Analyse de la localisation subcellulaire des protéines LEA (late embryogenesis abundant) chez Arabidopsis thaliana par des approches de bioinformatique et de biologie cellulaire

par Adrien Candat

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire végétale

Sous la direction de David Macherel.

Soutenue en 2012

à Angers , en partenariat avec Physiologie moléculaire des semences (Unité mixte de recherche INRA-INH-Université d'Angers) (laboratoire) .

mots clés

• Protéine LEA
• Localisation subcellulaire
• Expression transitoire
• Prédiction bioinformatique
• Arabidopsis -- Thèses et écrits académiques
• Bioinformatique structurale -- Thèses et écrits académiques
• Adressage des protéines -- Thèses et écrits académiques
• Peptides -- Thèses et écrits académiques

Résumé

L’anhydrobiose est la capacité de survivre à une dessiccation extrême, puis de reprendre un métabolisme normal après le retour à des conditions hydriques favorables. Il s’agit d’un phénomène reposant sur de multiples facteurs dont l’accumulation de protéines de stress de type LEA (Late Embryogenesis Abundant). Ces protéines généralement très hydrophiles et désordonnées à l’état natif sont regroupées en plusieurs familles sur la base de leur séquence primaire. Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, 51 gènes codant des protéines LEA ont été identifiés précédemment. L’objectif de ce travail a été de caractériser la localisation subcellulaire des protéines correspondantes, afin de mieux appréhender leurs fonctions encore énigmatiques. Des analyses bioinformatiques et des approches expérimentales basées sur l'expression transitoire de protéines de fusion fluorescentes dans des protoplastes ou des plantules d’Arabidopsis ont été utilisées. Les résultats expérimentaux ont mis en évidence les limites des analyses de localisation subcellulaire basées uniquement sur des prédictions in silico, et contribueront à améliorer les algorithmes de prédiction. Une méthodologie originale permettant d’identifier avec précision les sites de clivage des peptides d'adressage pour les protéines importées dans les organites a également été développée. L'ensemble des données acquises sur la localisation et la maturation des protéines LEA est en effet indispensable pour la conception de protéines recombinantes identiques aux protéines maturées in vivo dans les organites. Enfin, la mise en relation des observations de localisation subcellulaire effectuées au cours de ce travail avec les données de classification des protéines LEA et d’expression des gènes correspondant a permis de proposer de nouvelles hypothèses concernant leurs fonctions potentielles.

Résumé

Anhydrobiosis is the ability to survive severe desiccation and to resume normal metabolism upon a return to favorable conditions of water availability. It is a phenomenon based on mutiple factors, including the accumulation of stress proteins such as LEA (Late Embryogenesis Abundant) proteins. These proteins, which in the native state are generally very hydrophilic and disordered, are clustered into several families based on their primary sequence. In the model plant Arabidopsis thaliana, 51 genas encoding LEA proteins have been previously identified. The purpose of this work was to characterize the subcellular localization of these LEA proteins in order to better understand their, as yet, enigmatic functions. Bioinformatic analyses and experimental approaches, based on transient expression of fluorescent fusion proteins in Arabidopsis protoplasts, or seedlings, were used. The experimental data highlight the limits of in silico predictions for analysis of subcellular localization, and will help to improve prediction algorithms. An original method to accurately identify the cleavage sites of targeting peptides for organellar proteins has also been developed. The combination of experimentally determined subcellular location and identity of the mature LEA proteins is essential for the accurate design of corresponding recombinant proteins. Finally, examination of the relationship between the classification of LEA proteins, their gene expression, and their subcellular localization, enabled the development of novel hypotheses with respect to the putative functions of this important group of proteins.