Étude de l'organisation spatiale de la transcription des gènes d'ADN ribosomiques

Study of the spatial organization and transcription of rDNA

• Auteur / Autrice : Benjamin Albert
• Direction : Olivier Gadal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Nucléoles

Chromatine

ARN polymérases

ADN

Mots clés libres

RNA polymérase I

Nuclear

Transcription

Nucleolus

Hmgb

Chromosome

Organization

Rdna

Résumé

La production des ARN ribosomaux (ARNr) est une étape fondamentale dans la biogenèse des ribosomes et la croissance cellulaire. Elle représente près de 60% de l'activité transcriptionnelle. Cette activité a lieu au sein du nucléole qui est une structure dynamique variant de volume selon la croissance, et conservée dans le monde eucaryote. La production des ARNr et la formation du nucléole sont entièrement dépendantes de l'activité d'un unique complexe multiprotéique : l'ARN polymérase I (ARN pol I). Au cours de ma thèse nous avons étudié le fonctionnement de l'ARN pol I chez la levure de bière S. Cerevisiae à différents niveaux allant du rôle des sous unités composant ce complexe multiprotéiques, à sa matrice d'ADN jusqu'à l'influence des gènes d'ADNr dans l'organisation tridimensionnelle du génome. Concernant l'étude des sous-unités de l'ARN pol I, nous avons focalisé notre attention sur le rôle de deux protéines qui sont spécifiques de l'ARN Pol I, c'est à dire qui n'ont pas d'équivalent dans les autres ARN pol eucaryote. Il s'agit de Rpa34 et de Rpa49. Le travail de Beckouet et al. En 2007, auquel nous avons participé, a permis de montrer que ces protéines forment un hétérodimère essentiel pour le bon fonctionnement de l'ARN pol I. Par la suite, nos donnés nous ont permis de montrer l'existence de contacts entre les ARN pol I en cours de transcription qui seraient abolis en absence de ces deux sous unités spécifiques. Ces contacts seraient déterminants pour assurer le bon fonctionnement de l'ARN pol I au cours de l'élongation et l'intégrité du nucléole. D'autre part, pour améliorer notre compréhension de la transcription par l'ARN pol I, nous avons également étudié les gènes d'ADN ribosomiques constituant la matrice ADN de l'ARN pol I. Nous avons centré notre étude autour de la fonction d'une protéine HMG retrouvée sur ces régions. Ainsi, nous avons proposé que cette protéine Hmo1 serait un facteur d'élongation de l'ARN polymérase I conservé chez les eucaryotes qui permettrait de modifier la structure chromatinienne des gènes d'ADNr sous une forme favorable à la transcription. De plus, nous avons apporté de nouveaux éléments concernant la structure et la composition protéique des gènes d'ADNr qui ont été discutés dans une revue publiée au cours de cette thèse. Enfin, nous avons essayé de comprendre comment s'organise le chromosome qui contient ces régions les plus transcrites du génome, les gènes d'ADNr. Ainsi, nous avons étudié l'organisation du chromosome XII de levure S. Cerevisiae qui porte l'ensemble des répétitions des gènes d'ADNr. Pour comprendre et caractériser cette organisation, il a fallu prendre en compte la nature fondamentalement dynamique de l'architecture chromatinienne. En raison du caractère stochastique de ces mouvements, les paramètres appropriés à la description de la chromatine sont des grandeurs statistiques. Dans ce sens, grâce à des approches quantitatives d'analyse d'image, nous avons obtenu in vivo une carte de l'organisation spatiale du chromosome XII au sein du volume nucléaire. Ces donnés contribuent directement à la compréhension de l'organisation tri-dimensionnelle des génomes eucaryotes et renforcent l'idée que la physique des polymères est au centre des lois régissant cette organisation. Ce dernier point, a été spécifiquement détaillé dans une deuxième revue rédigée dans le cadre de cette thèse.

Pol I is the most active and abundant RNA polymerase in eukaryotes. Its enormous transcriptional output can best be visualized using the DNA spread method previously developed by Miller et al. (1969), where the 35S rRNA genes (rDNA) adopt a "Christmas tree" conformation. Pol I activity is associated with the largest nuclear body, the nucleolus, where all earlier steps of ribosome biogenesis take place. In this work, we studied transcription by pol I at different level. At level of the organization of rDNA genes in the nuclear volume, and at molecular level, we studied both function of specific subunits of pol I and role of HMGB proteins on transcription of rDNA. In part, we studied spatial organization of chromosome XII which contains all rDNA genes. Focusing on chromosome XII, we could sample positions of loci distributed on chromosome arms, and extrapolate gene territories determination of the entire chromosome. We could show that the nucleolus is a major determinant of the organization of genome of S. Cerevisiae. Moreover, we have also speculated about spatial organization of rDNA gene in the nucleolus. We have also shown that the Rpa49 and Rpa34 Pol I subunits, which do not have counterparts in Pol II and Pol III complexes, are functionally conserved. Statistical analysis of Miller spreads in the absence of Rpa49 demonstrates a fourfold decrease in Pol I loading rate per gene and decreased contact between adjacent Pol I complexes. We have suggested that Rpa34 and Rpa49 Pol I-specific subunits are essential for nucleolar assembly and for the High polymerase loading rate associated with frequent contact between adjacent enzymes. Moreover, we shown that Pol I activation is achieved by a conserved Pol I transcription factor containing an HMG-B box motif, called HMG-P protein. We could identify three interchangeable HMG-P by heterospecific complementation assay in Saccharomyces cerevisiae, Hmo1 in budding yeast, UBF1, the major regulator of rRNAs transcription in human and a newly characterize fission yeast Sp-Hmo1. We have proposed that stimulation is achieved by maintaining active genes competent for productive elongation.