Rôle de UHRF1 et de ses partenaires dans la régulation épigénétique des gènes suppresseurs de tumeurs

Role of UHRF1 and its partners in the epigenetic regulation of tumor suppressor genes

• Auteur / Autrice : Mayada Jreda
• Direction : Christian Bronner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN

Méthylation

Cancer -- Thérapeutique

Facteurs de transcription

Épigénétique

Résumé

La mémoire d’une cellule, c'est-à-dire sa capacité à exprimer un nombre bien défini de gènes est liée entre autres à la présence de petites modifications appelées modifications épigénétiques, positionnées sur la cytosine ou sur certains acides aminés des histones. Ces modifications déterminent la nature et les fonctions d’une cellule. Lorsque les cellules se multiplient, elles doivent transmettre ces informations à la descendance en recopiant fidèlement les méthylations de l’ADN et le code histone au bon endroit. La maintenance des profils de méthylation de l’ADN est réalisée par la DNMT1 (DNA MethylTransferase 1) qui est la plus abondante des méthyltransférases de l’ADN dans les cellules somatiques et a une préférence pour l’ADN hémi-méthylé et pour cela elle est considérée comme l’enzyme principale responsable de la duplication et de la maintienne des patrons de méthylation de brin parental au brin fille après la réplication de l’ADN. Incontestablement, l’UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING Finger Domain 1) apparaît de plus en plus comme un acteur essentiel dans la duplication de l’information épigénétique. L’UHRF1 est surexprimée dans plusieurs lignées cancéreuses dans lesquelles des modifications aberrantes des profils de méthylation de l’ADN et du code histone ont été constamment identifiées. L’UHRF1 joue un rôle en tumorigénèse par la dérégulation de l’expression des gènes qui sont bien connus pour jouer un rôle primordial en cancérogénèse comme les gènes topoisomérase II RB1, p16INK4A, p14ARF et RAR. L’UHRF1 est requise pour la prolifération cellulaire particulièrement pour la transition G1/S. L’UHRF1 pourrait contribuer à la cancérogénèse par la répression permanente de l’expression des gènes suppresseurs de tumeurs aboutissant à la perte du contrôle de la transition G1/S du cycle cellulaire. L’UHRF1 contient dans sa structure cinq domaines fonctionnels: le domaine « Ubiquitin-like » (NIRF_N domain) qui pourrait être impliqué dans l’interaction de l’UHRF1 avec le protéasome. Le « Cryptic Tandem Tudor Domain » (TTD domains) qui pourrait être impliqué dans la di / triméthylation de lysine 9 de l’histone H3. Le domaine PHD « The Plant Homeo Domain » qui est capable de lire le code histone et de discriminer entre les H3K4me3 et H3K4me2 (Histone 3 di- tri-méthylée à la lysine 4). Il a été proposé que le domaine PHD pourrait promouvoir l’activation génique ou la répression via son interaction avec H3K4 triméthylée et cette modification est une modification universelle de l’activation génique. Le « Set and Ring Finger Associated Domaine » (SRA domain) qui est trouvé seulement dans la famille UHRF chez les mammifères, est capable d’interagir à la fois avec HDAC1 (Histone DeACetylase 1) et les îlots CpG méthylés. Enfin, le domaine RING Finger « Really Interesting New Gene » qui a une activité E3 ligase pour l’histone H1, H2B et H3 mais assui pour la DNMT1. La présence de ces cinq domaines dans la structure de l’UHRF1 suggère que l’UHRF1 a la faculté de lire et réguler le code épigénétique. Pour comprendre le rôle de l’UHRF1 dans la régulation du code épigénétique et dans le but de rechercher des protéines qui pourraient interagir avec le domaine SRA de l’UHRF1, nous avons fait appel au système du double hybride en collaboration avec la société Hybrigenics (Paris). Plusieurs clones codants pour une séquence de 215 acides aminés ont été isolés, et montrent 100% d’homologie avec une séquence de la DNMT1 humaine. Nous avons appelé ce nouveau domaine de la DNMT1 le «SRA-binding domain » (SRA-BD). Cette interaction a été confirmée par GST-pull down et co-immunoprécipitation dans les cellules Jurkat et les cellules musculaires lisses immortalisées (SMC1-HVT). Ces résultats sont en accord avec d’autres travaux dans lesquels l’UHRF1 est proposée pour être capable de recruter la DNMT1 à l’ADN hémi-méthylé pour une duplication fidèle des patrons de méthylation de l’ADN. La structure du domaine SRA montre que ce domaine se comporte comme une « main », dont deux «doigts» font basculer une cytosine méthylée dans le grand sillon de l’ADN, permettant ainsi à la « paume » d’interagir avec le groupement méthyle. Ce mécanisme est appelé «methyl-cytosine-base-flipping mechanism». Pour comprendre le rôle de ce complexe UHRF1/DNMT1 sur l’expression génique des gènes suppresseurs de tumeurs p16INK4A, RB1 et sur l’expression du gène Facteur de Croissance Endothélial Vasculaire (VEGF), nous avons analysé leur expression dans les cellules « knocked-down » pour l’UHRF1 ou pour la DNMT1. Nous avons trouvé que la perte de fonction de l’UHRF1 ou de la DNMT1 aboutit à la diminution de l’expression du gène du VEGF, un facteur pro-angiogénique majeur tandis que les expressions des gènes suppresseurs de tumeurs p16INK4A et RB1 ont été significativement augmentées. Ces résultats indiquent que l’UHRF1 et la DNMT1 sont impliquées dans l’expression du gène VEGF probablement par l’interaction du domaine SRA de l’UHRF1 avec un nouveau domaine de la DNMT1 « SRA-BD » et l’augmentation de l’expression de p16INK4A. Nous avons proposé que la méthylation de l’ADN, l’ubiquitination et l’acétylation des histones soient présentées dans un grand complexe impliqué dans la réplication du code épigénétique que nous avons appelé « ECREM » pour « Epigenetic Code REplication Machinery », comportant Tip60 (Tat-interactive protein, 60 kDa). Tip60 est une histone acétyltransférase avec une spécificité vers la lysine 5 of H2A (H2AK5) et joue plusieurs rôles dans les processus du remodelage de la chromatine. Les expériences de co-immunoprécipitation et immunocytochemistrie ont montrées que Tip60 est présente dans le même complexe macromoléculaire avec l’UHRF1, la DNMT1 et HDAC1. Le « knockdown » de l’expression de l’UHRF1 ou de la DNMT1 par RNA interférence, augmente l’expression de Tip60 mais diminue significativement le niveau de l’acétylation de H2AK5. Ces résultats suggèrent que l’UHRF1 et la DNMT1 sont requises pour acétyler H2AK5 et que Tip60 participe à un grand complexe comportant UHRF1, HDAC1 et DNMT1 responsable de la réplication du code épigénétique. Ainsi, un effet direct de l’UHRF1 sur le code histone pourrait être dû à son activité enzymatique (E3 ligase) alors qu’un effet indirect pourrait être produit par le biais de son association avec ses partenaires. Ces résultats suggèrent que l’UHRF1 commande et régule le lien entre les modifications des histones et la méthylation de l’ADN dans le contexte de l’angiogénèse tumorale et la répression des gènes suppresseurs de tumeurs. Le « knockdown » de l’UHRF1 provoque une diminution du niveau de la méthylation de l’ADN et modifie la structure chromatinienne. La méthylation de l’ADN régule les modifications des histones considérant que la perte de la DNMT1 dans les cellules humaine du cancer du colon résulte en une diminution et distribution de H3K9me3 (histone H3 triméthylée sur la lysine 9). L’UHRF1 est nécessaire pour la maintenance des méthylations de l'ADN et interagit également avec H3K9me3 d’une manière indéterminée. Nous avons montré que l’UHRF1 contient un Tandem Tudor Domain (TTD) qui reconnaît les extrémités N-terminales de l’H3 associées à la lysine 9 triméthylée et à la lysine 4 non modifiée (H3K4me0/K9me3). La suppression de H3K4 montre l’importance de l’H3K4 non-modifiée pour que le domaine TTD de l’UHRF1 puisse reconnaître l’H3K9me3. L’UHRF1 déficiente en termes d’affinité pour l’H3K9me3 montre des localisations modifiées dans l’hétérochromatine et ne parvient pas à maintenir la répression d'un gène cible, p16INK4A. La capacité de TTD d’interagir avec l’histone H3K9me3 et avec l’histone H3K4 non-modifiée dans le même peptide suggère que la méthylation de l’ADN et les modifications des histones répressives sont fortement coordonnées par le biais de l’UHRF1, probablement par le recrutement des enzymes modificatrices de la chromatine HDAC1, DNMT1, Suv39H1 et G9a. L’ensemble de ces travaux nous a amené à mieux comprendre le rôle de l’UHRF1 et de ses partenaires DNMT1, HDAC1 et Tip60 dans la régulation du code épigénétique et dans la régulation de l’expression de certains gènes suppresseurs de tumeurs (p16INK4A et RB1). De même nos études soutiennent le fait que de trouver un inhibiteur spécifique de l’UHRF1 serait très intéressant pour une stratégie anti-cancéreuse ciblant la transmission de l’information épigénétique d’une cellule mère cancéreuse aux cellules filles.

The memory of a cell, i. E. , its ability to express a defined number of genes, is linked to the presence of small changes called epigenetic modifications, positioned on cytosine or on certain amino-acids of histones. These modifications determine the nature and functions of a cell. When the cells proliferate, they must transmit this information to the offspring by copying faithfully the methylation patterns of DNA and the histone code at the right place. The maintenance of methylation patterns of DNA is achieved by DNMT1 (DNA MethylTransferase 1) that is the most abundant DNA methyltransferase in somatic cells and has a preference for hemimethylated DNA. DNMT1 is considered as the main enzyme responsible for duplication and maintainance patterns of DNA methylation from the parental strand to the daughter strand after DNA replication. Undoubtedly, the UHRF1 (Ubiquitin-like containing PHD and RING finger domain 1) increasingly appears as a key player in the duplication of the epigenetic information. UHRF1 is overexpressed in several cancer cell lines in which aberrant changes of DNA methylation patterns and of the histone code have been identified. The UHRF1 plays a role in tumorigenesis by the maintainance of the deregulation of the expression of genes that are known to play an important role in carcinogenesis, such as topoisomerase II  RB1, p16INK4A, p14ARF and RAR. UHRF1 is required for cell proliferation, particularly for the transition G1/S. UHRF1 may contribute to carcinogenesis by the permanent repression of the expression of tumor suppressor genes leading to the loss of control of G1/S transition of the cell cycle. UHRF1 contains in its structure five functional domains: the ubiquitin-like domain (NIRF_N domain) which may be involved in the interaction of UHRF1 with the proteasome. The “Cryptic tandem Tudor domain” (TTD domains) that may be involved in the di/trimethylation of lysine 9 of histone H3. The PHD domain “The Plant Homeo Domain” which is able to read the histone code and discriminate between H3K4me3 and H3K4me2 (histone 3 di- tri-methylated at lysine 4). It was proposed that the PHD domain could promote gene activation or repression through its interaction with trimethylated H3K4 and this change is a universal modification of gene activation. The “Set and Ring Finger Associated domain” (SRA domain) which is only found in the family UHRF in mammals and is able to interact with both HDAC1 (Histone Deacetylase 1) and methylated CpG islands. Finally, the RING finger domain “Really Interesting New Gene” that has an E3 ligase activity towards histones H1, H2B and H3 but also towrds DNMT1. The presence of these five domains in the structure of UHRF1 suggests that UHRF1 has the ability to read and control the epigenetic code. To understand the precise role of UHRF1 in the regulation of the epigenetic code and in order to search for proteins that could interact with the SRA domain of UHRF1, we used the two-hybrid system in collaboration with Hybrigenics (Paris). Several clones encoding a sequence of 215 amino acids were isolated, and showed 100% homology with a sequence of a new domain of the human DNMT1. We called this new domain of DNMT1 the "SRA-binding domain" (SRA-BD). This interaction was confirmed by GST pull-down assay and coimmunoprecipitation experiments in Jurkat cells and immortalized smooth muscle cells (SMC1-HVT). These results are consistent with other studies which showed that UHRF1 is able to recruit DNMT1 to hemimethylated DNA for faithful replication of DNA methylation patterns. Analysis of the SRA domain structure demonstrates that this domaine behaves as a “hand” with a “palm’’ that holds the methylated cytosine residue, after which two “fingers” flip the methylated cytosine out from the DNA helix into the major DNA groove. The flipped methylated cytosine enables UHRF1 to be anchored at the hemimethylated site to give the time necessary for DNMT1 to methylate the newly synthesized DNA. This mechanism is called "methyl-cytosine base-flipping mechanism ". To understand the role of the UHRF1/DNMT1 complex on gene expression of tumor suppressor genes p16INK4A, RB1 and on the expression of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), we analyzed their expression in UHRF1 or DNMT1-knocked-down cells. We found that the loss of UHRF1 or DNMT1 function leads to decreased expression of VEGF, a major pro-angiogenic factor, while the expressions of the tumor suppressor genes p16INK4A and RB1 were significantly increased. These results indicate that UHRF1 and DNMT1 are involved in VEGF gene expression probably by the interaction of the SRA domain of UHRF1 with the "SRA-BD" of DNMT1 and increasing the expression of p16INK4A. It was proposed that DNA methylation, ubiquitination and acetylation of histones are presented in a large complex involved in replication of the epigenetic code that was named "ECREM" for "Epigenetic Code REplication Machinery", with Tip60 (Tat-interactive protein, 60 kDa). Tip60 is a histone acetyltransferase with specificity towards lysine 5 of H2A (H2AK5) and plays multiple roles in the processes of chromatin remodeling. The co-immunoprecipitation and immunocytochemistry experiments have shown that Tip60 is present in the same macromolecular complex with UHRF1, DNMT1 and HDAC1. The knockdown expression of UHRF1 or DNMT1 by RNA interference increased the expression of Tip60 but significantly decreased the level of acetylation of H2AK5. These results suggest that UHRF1 and DNMT1 is required to acetylate H2AK5, and Tip60 participates in a large complex including UHRF1, HDAC1 and DNMT1 responsible for the replication of the epigenetic code. Thus, a direct effect of UHRF1 on the histone code might be due to its enzymatic activity (E3 ligase) while an indirect effect could be produced through its association with its partners. These results suggest that UHRF1 control and regulate the relationship between histone modifications and DNA methylation in the context of tumor angiogenesis and suppression of tumor suppressor genes. UHRF1 knockdown causes a decrease in the levels of DNA methylation and chromatin structure changes. DNA methylation controls histone modifications considering that the loss of DNMT1 in human colon cancer cells results in a decrease and redistribution of H3K9me3 (histone H3 trimethylated on lysine 9). UHRF1 is necessary for maintenance DNA methylation and also interacts with H3K9me3 in an unknown manner. We showed that UHRF1 contains a Tandem Tudor Domain (TTD) that recognizes H3 tail peptides with the heterochromatin-associated modification state of trimethylated lysine 9 and unmodified lysine 4 (H3K4me0/K9me3). Mutant UHRF1 protein deficient for H3K4me0/K9me3 binding shows altered localization to heterochromatic chromocenters and fails to reduce expression of a target gene, p16INK4A, when overexpressed. Our results demonstrate that DNA methylation and repressive histone modifications are highly coordinated through UHRF1, probably by the recruitment of chromatin modifying enzymes HDAC1, DNMT1, G9a and Suv39H1. Finally this work led us to better understand the role of UHRF1 and its partners DNMT1, HDAC1 and Tip60 in regulating the epigenetic code and in regulating the expression of some tumor suppressor genes (p16INK4A and RB1). Similarly, our studies support the idea that finding a specific inhibitor of UHRF1 would be very interesting for a anti-cancer therapy targeting the transmission of the epigenetic information from a mother cancer cell to daughter cells.