Thèse soutenue

Caractérisation d’inhibiteurs de complexes CDK‐cycline chez Arabidopsis thaliana
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Auteur / Autrice : Laurine Millan
Direction : Nathalie Glab-Perret
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie végétale
Date : Soutenance le 27/09/2011
Etablissement(s) : Paris 11
Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences du Végétal (1992-2015 ; Orsay, Essonne)
Partenaire(s) de recherche : Institut : Institut de Biologie des Plantes (Orsay, Essonne ; 1994-2014)
Jury : Président / Présidente : Michaël Hodges
Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Glab-Perret, Michaël Hodges, Mohammed Bendahmane, Éric Monfroy, Séverine Planchais
Rapporteurs / Rapporteuses : Mohammed Bendahmane, Éric Monfroy

Résumé

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Comme pour tous les organismes pluricellulaires, la croissance et le développement des plantes nécessitent une coordination de la production de cellules via la mitose et la différenciation cellulaire. La progression du cycle cellulaire est contrôlée par les complexes CDK-cycline. Les inhibiteurs de ces complexes, les CKIs, représentent d’excellents candidats pour réguler cet équilibre entre les processus de prolifération et différentiation cellulaires qui ont lieu au cours du développement. Afin de mettre en évidence le rôle d’intégrateurs potentiel des CKIs, le développement floral a été utilisé en tant que modèle.Grâce à l’utilisation de la qRT-PCR, nous avons montré que durant le développement floral d’Arabidopsis thaliana, un groupe restreint de CKIs était exprimé. Nous avons choisi de travailler sur les deux CKIs les plus exprimés, KRP6 et KRP7. Une caractérisation fine de leur profil d’expression durant le développement a été réalisée en utilisant des approches complémentaires telles que l’analyse de l’activité de leur promoteur, de la dynamique de leur transcrit, de leur expression protéique et de leur régulation post-traductionnelle.Jusqu’à présent, seules des approches ‘gain de fonction’ ont été utilisées pour étudier le rôle des CKIs chez les plantes. C’est pour cela que nous avons choisi des approches ‘perte de fonction’ pour analyser le rôle de KRP6 et de KRP7 au cours du développement floral. Ainsi, nous avons généré des doubles mutants d’insertion krp6-krp7, krp3-krp6, krp3-krp7, des triples mutants d’insertion krp3-krp6-krp7 et diverses lignées ARN interférence avec des promoteurs spécifiques. Malgré l’étude de ces nombreuses lignées, nous n’avons pas réussi à mettre en évidence des effets phénotypiques associés à l’absence de la fonction CKI au cours du développement floral. Ces résultats mettent en évidence la redondance fonctionnelle qui semble exister entre les KRPs, ainsi un quadruple mutant pourrait être nécessaire pour entrainer des modifications développementales. Afin de mieux comprendre cette fonction d’intégrateurs des KRPs au cours du développement floral, les partenaires de KRP6 et de KRP7 ont été recherchés. Des criblages double-hybride ont été réalisés afin d’identifier des ADNc, spécifiques du développement floral, codant des protéines capables d’interagir avec KRP6 et KRP7. De façon intéressante, mis à part les cyclines de type D, un nouveau type d’interaction a pu être mis en évidence. Un sous-groupe de la famille des rémorines est capable d’interagir avec KRP6 ou KRP7 en système double-hybride. Les rémorines sont des protéines spécifiques du règne végétal, associées à la membrane plasmique mais dont la fonction reste à clarifier. Une approche BiFC en protoplastes BY-2 a permis de confirmer l’existence de ce type d’interaction. De plus, l’influence des rémorines sur la localisation intracellulaire des KRPs a été étudiée. En présence de ces nouveaux partenaires, KRP7 est capable d’adopter une localisation nucléo-cytoplasmique.Enfin, des résultats récents ont montré que l’AMPK était capable de phosphoryler p27KIP1, l’homologue fonctionnel des KRPs chez les mammifères. Ces évènements de phosphorylation entrainent des modifications de sa localisation intracellulaire et de son activité inhibitrice vis-à-vis des complexes CDK-cycline. Après la réalisation d’analyses in silico ayant permis de prédire des sites putatifs de phosphorylation par SnRK1, l’homologue de l’AMPK chez A. thaliana, pour certains KRPs, la protéine KRP6 sous forme recombinante a été utilisée pour réaliser des essais kinase in vitro. Une phosphorylation de KRP6 est détectée en présence de la sous unité catalytique activée de SnRK1. Contrairement aux mammifères, cet évènement de phosphorylation entraine une altération de l’activité inhibitrice de KRP6 sans modification de sa localisation intracellulaire. Cette abolition de l’activité de KRP6 a été confirmée in planta. En effet, les phénotypes associés à la surexpression de KRP6 peuvent être atténués par la surexpression simultanée de la sous-unité catalytique de SnRK1. L’existence de ce lien entre KRP6 et SnRK1 met en évidence une relation directe entre l’homéostasie énergétique et la prolifération cellulaire.