Single-Molecule Studies of the Initiation of Bacterial Transcription Coupled Repair

• Auteur / Autrice : Kévin Ho Wan
• Direction : Terence Strick
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Frontières du vivant
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

DNA-directed RNA polymerases

Altération de l'ADN

ADN -- Réparation

Magnétisme

Résumé

La réparation de l'ADN couplée à la transcription (TCR), qui cible les lésions de l'ADN perturbant la progression du complexe d'élongation au cours de la transcription, est un mécanisme important dans le maintien de l'intégrité du génome. La TCR est retrouvé aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Certaines maladies héréditaires humaines, comme le syndrome de Cockayne, sont associées à des anomalies dans cette voie de réparation. Chez la bactérie Escherichia coli, la translocase TRCF, produit du gène mfd, joue un rôle central dans cette réponse cellulaire: elle reconnaît une ARN polymérase bloquée en élongation, dissocie le complexe d'élongation et recrute la machinerie de réparation UvrABC. Nous avons étudié le mécanisme de la TCR par micromanipulation de molécules d'ADN individuelles à l'aide d'une pince magnétique. Cette approcha nous a permis de suivre la dissociation d'une ARN polymérase par TRCF en temps réel. L'analyse de la distribution des temps de dissociation du complexe d'élongation à différentes concentrations de TRCF nous a permis de mettre en évidence et de caractériser les étapes cinétiquement limitantes du recrutement de TRCF et de son activité catalytique au cours de la TCR. Ainsi, notre étude montre que la dissociation de TARN polymérase par TRCF se fait en 3 étapes: (i) recrutement de TRCF sur la polymérase bloquée, (ii) activation de TRCF et initiation de la dissociation par réenroulement de 2/3 de la bulle de transcription et (iii) dissociation complète de l'ARN polymérase. Nous proposons que cette dernière étape, dont la durée est relativement longue, permettrait à TRCF de recruter les enzymes de réparation par interaction directe.

Transcription coupled repair (TCR), a sub-pathway of the nucleotide excision repair mechanism, is activated when a RNA polymerase (RNAP) is arrested during transcription by DNA damage. TCR is a ubiquitous cellular response important for maintenance of DNA integrity. Some human genetic disorders are associated with defect on TCR, like the Cockayne syndrom for instance. In the bacterium Escherichia coli, TRCF, the product of the mfd gene, is the DNA translocase that couples transcription and DNA repair: it recognizes a stalled ternary elongation complex, dissociates it, and recruits the UvrABC repair machinery. We used a single molecule approach, by rneans of magnetic tweezers, to study the initation of TCR. This approach allowed us to monitor the dissociation of a single RNAP by a single TRCF in real time. Statistical analysis of the time required to dissociate the stalled RNAP at different concentrations of TRCF has shown that the displacement of the ternary elongation complex consists is a three steps process: (i) recruitment of TRCF to the stalled RNAP, (ii) activation of TRCF and initiation of the dissociation of RNAP by rewinding of 2/3 of the transcription bubble, and (iii) complete dissociation of the elongation complex. The complex present during this last step is characterized by a long lifetime, which suggests that it would behave as a temporally reliable marker of DNA damage, favorizing the recruitment of the UvrA.