Etudes structurales et dynamiques des acides nucléiques impliqués dans le premier transfert de brin lors de la transcription inverse du VIH-1 en présence de la protéine de nucléocapside NCp7

par Ali Bazzi

Thèse de doctorat en Structure, fonction et ingéniérie des protéines

Sous la direction de Olivier Mauffret.

Soutenue en 2011

à Paris 7 .

mots clés

• ADN viral
• Répétition terminale longue du VIH
• Modèles moléculaires
• VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1) -- génétique
• Données de séquences moléculaires

Résumé

La protéine de nucléocapside du VIH-1 NCp7 assume plusieurs fonctions au cours du cycle de réplication du VIH-1. Elle est notamment impliquée dans la facilitation des transferts de brin qui se produisent au cours de la transcription inverse. Celle-ci consiste en une suite d'étapes qui permet la conversion du génome ARN simple brin en une molécule d'ADN double-brin. Au cours de ce processus deux transferts de brin obligatoires se produisent. Je me suis intéressé au premier transfert de brin dans lequel l'ADN néo-synthétisé migre de l'extrémité 5' du génome vers l'extrémité 3'. Les séquences ADN et ARN principalement impliquées ont été identifiées: il s'agit de l'ARN TAR et de son complémentaire l'ADN cTAR. Ces séquences, longues d'une cinquantaine de résidus, se replient en structures tiges-boucles; l'association TAR-cTAR est facilitée par la protéine de nucléocapside du VIH-1 (NCp7). Dans notre travail, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'ADN cTAR et à ses I interactions avec la protéine de NCp7. Dans la première partie nous avons étudié la partie supérieure de l'élément cTAR (mini-cTAR: 26 résidus, cette taille a été choisie pour rendre possible l'étude par RMN). Les résultats indiquent que la tige haute (située entre la boucle apicale et la boucle interne) est \ stable, tandis que la tige basse (située entre la boucle interne et l'extrémité libre) est fortement déstabilisée. L'étude des propriétés structurales et dynamiques de la molécule montre que des échanges conformationnels se produisant au sein de la boucle interne seraient à l'origine de la déstabilisation de la tige basse. Les études d'interaction de la NC sur cette molécule nous ont permis de montrer que la NC se fixait sur la séquence T₂₄GG₂₆ située à l'extrémité 3' de la molécule. L'observation d'un nombre important de nOes intermoléculaires et la bonne résolution des spectres nous ont permis de déterminer la structure tridimensionnelle du complexe. La thymine située à l'extrémité 5' interagit avec les résidus du premier doigt de zinc N-terminal et la guanine située à l'extrémité 3' est insérée dans un plateau hydrophobe dans le deuxième doigt de zinc C-terminal. Des comparaisons avec les autres complexes NC:ADN/ARN résolus soulignent que la protéine semble capable de reconnaître la polarité des chaînes d'acides nucléiques (ADN: le premier doigt de zinc reconnaît les résidus d'acide nucléique situés à l'extrémité 5' alors que le deuxième doigt de zinc reconnaît les résidus situés à l'extrémité 3' l'ARN: l'inverse semble se produire). Afin de mieux comprendre les bases moléculaires de la sélection par la NC du site TGG nous avons entrepris des études de relaxation du isC sur l'élément mini-cTAR. Les résultats, analysés avec le programme MODELFREE montrent que plusieurs guanines non appariées sont impliquées dans des appariements transitoires et ne peuvent donc constituer des sites d'interaction forts. Afin d'examiner l'impact de l'allongement de l'ADN mini-cTAR sur la fixation par la NC, nous avons étudié l'interaction entre la NC(11-55) et Emini-cTAR (33 résidus, une version "allongée" de mini-cTAR). La NC apparaît de nouveau capable de reconnaître avec une certaine préférence une guanine (située dans la boucle interne). Nous observons aussi d'intéressants effets de déstabilisation des structures secondaires par laNC. Les résultats sont discutés en les comparant avec les données de la littérature.

Titre traduit

Dynamic and structural studies of the nucleic acids involved in the first strand transfer of the HIV-1 reverse transcription in the presence of the nucleocapsid protein

Résumé

The NCp7 nucleocapsid protein of HIV-1 has several fonctions during the replication cycle of HIV-1. It is particularly involved in the facilitation of strand transfer that occur during reverse transcription. It consists in a succession of steps that allows the conversion of the single stranded RNA genome in a double stranded DNA. During this process two strand transfer occur. I am interested in the first strand transfer in during which the neo-synthesized DNA migrates from the 5 'extremity of the genome to the 3' extremity. DNA and RNA sequences mainly involved have been identified: the TAR RNA and its complementary DNA cTAR. These sequences, long of about fifty residues, fold in stem-loops structures; the TAR-cTAR association is facilitated by the nucleocapsid protein of HIV-1 (NCp7). In our work, we are particularly interested in cTAR DNA and its interactions with the NCp7 protein. In the first part we have studied the upper part of the cTAR element (mini-cTAR: 26 residues, this size was chosen to make possible the study by NMR). The results indicate that the upper stem (located between the apical loop and internal loop) is stable, while the lower stem (between the internal loop and the free end) is strongly destabilized. Structural and dynamic properties studies of j the molecule show that a conformational exchange occurring within the internal loop could be I responsible for the destabilization of the lower stem. Interaction studies of the NC in this molecule show that the NC binds to the sequence T24GG26 located at the 3 'end of the molecule. The observation of a large number of intermolecular nOes and high resolution spectra permit the resolution of the three dimensional structure of the complex. ! Thymine located at the 5 'end interacts with residues of the N-terminal zinc knuckle and guanine located at the 3' end is inserted into a hydrophobic plateau in the C-terminal zinc knuckle. Comparisons with other complex NC: DNA / RNA resolved show that the protein seems able to j recognize the polarity of the chains of nucleic acids (DNA: the first zinc finger recognizes the nucleic acid residues located at the 5 ' while the second zinc finger recognizes residues located at the 3 'RNA: the reverse seems to happen). To better understand the molecular basis of selection the TGG site by the NC we undertook studies of 13C relaxation of the element mini-cTAR. The results, analyzed with the program MODELFREE show that several unpaired guanines are involved in transient pairing and can not be constitute a strong sites of interaction. To examine the impact of the elongation in DNA mini-cTAR on the binding of the NC, we studied the interaction between NC (11-55) and Emini-cTAR(33 residues, an "extended" version of mini-cTAR). The NC appears again able to recognize with preference a guanine (located in the internal loop). Interestingly, we also observe the destabilization secondary structures by the NC. The results are discussed in comparison with literature data.