Caractérisation fonctionnelle et pharmacologique de mutations du transporteur de la créatine (SLC6A8) in vitro et chez des patients atteints du déficit cérébral en créatine

par Vassili Valayannopoulos

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire et cellulaire

Sous la direction de Arnold Munnich.

Soutenue en 2011

à Paris 5 .

mots clés

• Créatine
• Ovules
• Xénopes
• Électrophysiologie
• Créatine -- physiopathologie
• Xenopus
• Biologie moléculaire
• Analyse fonctionnelle
• Électrophysiologie

Résumé

La créatine (Cr) joue un rôle important dans l’homéostasie énergétique cérébrale mais possède également des propriétés de neuromédiateur. Le déficit du transporteur cérébral de la Cr est une maladie génétique due à des mutations du gène SLC6A8. C’est une cause fréquente de retard mental lié à l’X et associe d’autres signes, musculaires, psychiatriques et une épilepsie. Il n’existe pas de traitement ayant fait preuve d’efficacité. Dans la 1ère partie du travail j’ai étudié l’effet de 4 mutations non tronquantes sur la capacité de transport et sur les propriétés électrogéniques de SLC6A8. J’ai utilisé les fibroblastes en culture des patients et un système d’expression dans l’œuf de Xenope. Les capacités de transport et les propriétés électrophysiologiques sont totalement abolies pour ces 4 mutations, malgré une expression et une localisation normales. En parallèle j’ai étudié les caractéristiques de 6 patients porteurs du déficit de SLC6A8, traités pendant 2,5 ans par la Cr et ses précurseurs L-Arg et L-Gly sans efficacité. J’ai alors étudié in vitro les effets pharmacologiques de 4 analogues structuraux de la créatine en utilisant les modèles cellulaires précédents. Seul le GPA, s’avère être un véritable agoniste de la créatine, transporté efficacement par SLC6A8 avec les mêmes propriétés électrogéniques alors que PCr-Mg-CPLX a une activité partielle. En conclusion, les résultats démontrent que toutes les mutations décrites dans ce travail ont des conséquences fonctionnelles majeures et indistinguables. Par ailleurs ces systèmes de caractérisation pharmacologique permettront possiblement d’identifier et d’étudier le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules.

Titre traduit

Functional, biochemical and pharmacological properties of creatine (SLC6A8) deficiency in vitro and patients presenting with brain creatine deficiency syndrome

Résumé

Creatine (Cr) is required for the utilization of ATP-derived energy at sites of high-energy utilization (muscle, brain, and heart). Mental retardation coupled with epilepsy, speech and behavior disorders are clinical hallmarks of the brain creatine transporter (SLC6A8) deficiency syndrome. Treatment trials with Cr and its precursors have been proven in most cases unable to treat efficiently the disease. Various types of molecular defects including truncating, splice and missense mutations have been described. The first aim of this work was to study the functional and pharmacological properties of 4 non truncating SLC6A8 mutations causing cerebral Cr deficiency syndrome including 2 not previously reported. I used 2 in vitro systems, patients’ fibroblasts and the heterologous expression system in Xenopus oocytes, to study the electrophysiological properties of the 4 mutants. Mutant transporters were completely inactive in all aspects studied despite normal expression and localization. In parallel, I studied the characteristics of 6 patients affected with SLC6A8 deficiency treated for 2. 5 years by Cr and its precursors L-Arg and L-Gly with no efficacy. I also studied the pharmacological effects of Cr and 4 Cr analogs. Among them, GPA showed electrophysiological properties similar to creatine whereas a phosphocreatine derivative, PCrMGX, showed partial activity. In conclusion, our data establish that these SLC6A8 mutations are responsible for equivalent severe functional impairment of the Cr transporter independent from the type of the molecular defect. We also conclude that these models may be used in the future to identify and study the therapeutic potential of new molecules.