Etude biologique de cibles dans le processus angiogénique

par Rafika Jarray

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Christiane Garbay et de Françoise Raynaud.

Soutenue en 2011

à Paris 5 , en partenariat avec Université Paris Descartes. Faculté de pharmacie de Paris (autre partenaire) .

mots clés

• Protéine kinase d'adhésion focale FAK
• Protéine Phactr-1
• Néovascularisation -- Thèses et écrits académiques
• Antiangiogéniques -- Thèses et écrits académiques
• Apoptose -- Thèses et écrits académiques
• Actine -- Thèses et écrits académiques
• Neuropilines -- Dissertations universitaires
• Récepteur-1 au facteur croissance endothéliale vasculaire -- Dissertations universitaires
• Facteur de croissance endothéliale vasculaire de type A -- Dissertations universitaires

Résumé

Le besoin de définir de nouveaux marqueurs prédictifs de l’activité thérapeutique des anti-angiogéniques actuels devient nécessaire. Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux régulant l’angiogenèse permettrait d’améliorer leur efficacité. Nous avons cherché, d’une part à identifier en aval de l’axe VEGF/VEGFRs de nouvelles protéines clés impliquées dans la régulation de l’angiogenèse, et d’autre part à développer des inhibiteurs potentiels d’une protéine tyrosine kinase, FAK (Focal Adhesion Kinase). 1. Nous avons identifié par criblage différentiel un gène codant pour Phactr-1 (Phosphatase-1 and Actin Regulator) dont l’expression est modulée par le VEGF-A165 dans les cellules primaires endothéliales humaines (HUVEC). L’extinction de Phactr-1 par siRNA entraîne une altération de la tubulogenèse in vitro, ainsi que l’activation de la voie apoptotique extrinsèque. Sa déplétion perturbe également les cycles de polymérisation/dépolymérisation de l’actine sous stimulation par le VEGF-A165. Ceci s’accompagne d’un défaut de la dynamique du lamellipode. De plus, l’expression de Phactr-1 est modulée par les récepteurs et corécepteurs VEGFR-1/NRP-1. 2. Nous avons développé des inhibiteurs chimiques du domaine kinase de FAK et procédé à leur évaluation biologique. L’activité biochimique des différentes librairies a été évaluée par un test sur protéine purifiée utilisant le TR-FRET. Ces librairies ont été testées sur les HUVEC pour évaluer leur activité cytotoxique. Les meilleurs composés inhibent la phosphorylation de FAK dans les HUVEC et également la tubulogenèse in vitro. Les résultats obtenus nous ont permis d’établir des pharmacomodulations en vue de développer des composés plus sélectifs.

Titre traduit

Biologic studies of angiogenic targets

Résumé

Molecular biomarker research in angiogenesis inhibition is an actively growing field. Although current data are extremely promising, it is still uncertain which biomarkers can reliably predict the efficacy of anti-angiogenic therapy. With increasing numbers of inhibitors being developed, the need for biomarkers is more critical than ever for clinical use in human disease management and knowledge. We sought, first to identify downstream of the axis VEGF / VEGFR new key proteins involved in the regulation of angiogenesis, and also to develop potential inhibitors of a protein tyrosine kinase, FAK(Focal Adhesion Kinase). 1. We identified by differential screening Phactr-1 gene (Phosphatase-1 and Actin Regulator) whose expression is modulated by VEGF-A165 in primary human endothelial cells (HUVEC). The extinction of Phactr-1 by siRNA results in impaired tubulogenesis in vitro, and activation of the extrinsic apoptotic pathway. Its depletion also disrupts the cycles of polymerization / depolymerization of actin by stimulation with VEGF-A165. This is accompanied by a defect in lamellipodium dynamics. In addition, the expression of Phactr-1 was modulated by the VEGFR-1/NRP-1. 2. We have developed chemical inhibitors of the kinase domain of FAK and performed their biological evaluation. The biochemical activity of the different libraries was assessed by a test on purified protein using the TR-FRET. These libraries were tested on HUVEC to assess their cytotoxic activity. The best compounds inhibit the phosphorylation of FAK in HUVEC and also tubulogenesis in vitro. The results allowed us to establish pharmacomodulations to develop more selective compounds.