The effect of heating, glycation and mutations on structural, interactions and allergenicity of bovine β-lactoglobulin

• Auteur / Autrice : Asghar Taheri-Kafrani
• Direction : Thomas Haertlé, Abdol-Khaled Bordbar
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Végétal-Environnement-Nutrition-Agro-Alimentaire-Mer (Angers)
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Nantes. Faculté des sciences et des techniques

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sérotonine

Lactoglobulines

Mots clés libres

B-lactoglobulines

Interactions

Allergies

Résumé

La β-lactoglobuline (β-Lg) est la protéine la plus abondante du lactosérum du lait de vache et des autres mammifères, elle appartient à la famille des lipocalines. Toutefois, elle est absente dans le lait de primates. C’est une protéine globulaire d'environ 18 kDa formant une structure en feuillet β (appelé calice). Chaque monomère contient deux ponts disulfures et une cystéine en position 121 (C121). Ce groupement thiol libre joue un rôle important dans l'agrégation de la β-Lg induite par la chaleur et, éventuellement, dans le maintien de sa stabilité de conformation. La fonction biologique de la β-Lg n'est pas claire, mais son rôle potentiel dans le transport des acides gras dans le tube digestif a été suggéré. La β-Lg est connue comme l'un des allergènes majeurs dans le lait. Parmi les traitements technologiques le chauffage est le plus couramment appliqué au cours des procédés de transformation du lait. Malgré la fréquence d'utilisation du chauffage, les effets des traitements thermiques de la β-Lg sur sa dénaturation et sa reconnaissance par les IgE de patients ne sont pas décrits. La fixation des IgE de patients allergiques au lait de vache à la β-Lg native, et à la β-Lg chauffée dans la gamme de température de 65-95 °C, a été étudiée par ELISA. La β-Lg a été soumise à des modifications au cours du chauffage en présence des sucres réducteurs par la réaction de Maillard. La fixation des IgE de patients à la β-Lg glycosylée a également été mesurée. La perte de structures tertiaires et secondaires de β-Lg par chauffage au dessus de 75 °C a entraîné une diminution de sa reconnaissance par les IgE, dont les réactivités différent entre les patients. L'intensité de la baisse de la liaison IgE a également été observée dans le cas des β-Lg fortement glycosylées. L'expression au niveau la levure Pichia pastoris d'un mutant de l'espèce bovine β- Lg, dans lequel le groupement C121 a été changé en Ser (C121S) a été réalisée au cours de cette étude. La mutation C121S bloque complètement l'agrégation irréversible induite par un traitement thermique. La fixation des IgE, obtenus de patients allergiques au lait de vache, avec la β-Lg native, β-Lg type sauvage et la β-Lg mutée C121S a également été étudiée par ELISA. La β-Lg peut complexer des lipides tels que les acides butyrique et l'acide oléique ainsi que d’autres variété de ligands. La sérotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT) est un composé important qu'on trouve chez les animaux et les plantes. Elle est connue par ses diverses fonctions, y compris la régulation de l'humeur, l'appétit, le sommeil, la contraction musculaire, et certaines fonctions cognitives comme la mémoire et l'apprentissage. Dans la dernière partie de cette étude, l'interaction de la sérotonine et la sérotonine arachidonyl (AA-5HT) avec β-Lg a été étudiée par dichroïsme circulaire (CD) et par fluorescence. Ces deux ligands interagissent avec β-Lg pour former des complexes équimolaires. La constante d’affinité du complexe sérotonine/β-Lg est compris entre 105 et 106 M-1, tandis que celle du complexe AA-5HT/β-Lg est comprise entre 104 et 105 M-1. Les constantes d’affinités observées sont plus élevés en milieu hydro-éthanolique (25 % EtOH). Selon les résultats des UV proche et lointain en CD, ces ligands n'ont aucune influence apparente sur la structure secondaire de la β-Lg, mais ils déstabilisent partiellement la structure tertiaire. La liaison avec la β-Lg pourrait expliquer l'un des mécanismes périphériques de la régulation de la sérotonine et de ses dérivés au niveau de l'intestin des animaux nourris au lait.

β-Lactoglobulin (β-Lg) is a lipocalin, which is the major whey protein of cow milk and the milk of other mammals. However, it is absent from milk of primates. This globular protein of about 18 kDa is folded forming a -barrel (or calyx) structure. Each monomer contains two disulphide bonds and one cysteine at position 121 (C121). This free thiol plays an important role in the heat-induced aggregation of β-Lg, and, possibly, in the maintenance of its conformational stability. The biological function of β-Lg is not clear, but its potential role in carrying fatty acids through the digestive tract has been suggested. β-Lg is also one of major allergens in milk. Heating is one of the most common technologic treatments applied during many milk transformations. Despite the frequency of use of heating, the effects of heating β-Lg and its denaturation on its recognition by IgE of patients are not fully described. Binding of IgE from patients with cow milk allergy to native β-Lg and to heated β-Lg in the temperature range 65-95°C was measured by ELISA. Since β-Lg can be subjected to modifications during heating by the existing reducing sugars in the milk through Maillard reaction, binding of IgE of patients to glycated β-Lg was also measured. Loss of tertiary and secondary structures of β-Lg by heating above 75°C resulted in a decrease in its recognition by IgE, whose reactivities differ between the patients. The intensity of the decrease of IgE binding was also observed in case of intensively glycated β-Lg. The expression in the yeast Pichia pastoris of a mutant bovine β-Lg, in which C121 was changed into Ser (C121S) was accomplished during this study. The C121S mutation blocks completely the irreversible aggregation induced by heat treatment. Binding of IgE from patients with cow milk allergy to native β-Lg, wild-type β-Lg and C121S mutant β-Lg was aslo measured by ELISA. β-Lg has been found in complexes with lipids such as butyric and oleic acids and has a high affinity for a wide variety of compounds. Serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT), an important compound found in animals and plants, has various functions, including the regulation of mood, appetite, sleep, muscle contraction, and some cognitive functions such as memory and learning. In the last part of this study, the interaction of serotonin and one of its derivatives, arachidonyl serotonin (AA-5HT), with β-Lg was investigated using circular dichroism (CD) and fluorescence intensity measurements. These two ligands interact with β-Lg forming equimolar complexes. The binding constant for the serotonin/β-Lg interaction is between 105 and 106 M-1, while for the AA-5HT/β-Lg complex it is between 104 and 105 M-1 as determined by measurements of either protein or ligand fluorescence. The observed binding affinities were higher in hydroethanolic media (25 % EtOH). The interactions between serotonin/β-Lg and AA-5HT/β-Lg may compete with self-association (micellization) of both the ligand and the protein. According to far-and near-UV CD results, these ligands have no apparent influence on β-Lg secondary structure, however they partially destabilize its tertiary structure. Their binding by β-Lg may be one of the peripheral mechanisms of the regulation of the content of serotonin and its derivatives in the bowel of milk-fed animals.