Caractérisation de nouveaux substrats moléculaires des agonistes hallucinogènes du récepteur 5-HT2A par une approche phosphoprotéomique quantitative.

Characterization of novel substrates of the hallucinogenic agonists of 5-HT2A receptors by a quantitative phosphoproteomics approach.

• Auteur / Autrice : Samah Karaki
• Direction : Philippe Marin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interface chimie-Biologie : systèmes moléculaires à visée thérapeutique
• Date : Soutenance le 23/09/2011
• Etablissement(s) : Montpellier 2
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; ....-2014)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : UMR 5203 - Institut de Génomique Fonctionnelle - IGF
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Joël Bockaert, Marin Philippe, Clotilde Mannoury La Cour, Franck Vandermoere
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Michèle Darmon, Ikram El Yazidi-Belkoura

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hallucinogènes

Agonistes du récepteur 5-HT1A

Mots clés libres

Récepteurs 5-HT2A

Approche phosphoprotéomique.

Effets psychoactifs

Composés hallucinogènes

Agonistes biaisés

Rsk2

5-HT2A receptors

Phosphoproteomics approach

Psychoactive effects

Hallucinogenic compounds

Biased agonists

Rsk2

Résumé

Le récepteur de la sérotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT) 2A a été identifié comme la cible principale des hallucinogènes psychédéliques comme le diéthylamide de l'acide lysergique (LSD). Ces agonistes sont connus pour reproduire quelques uns des principaux symptômes de la schizophrénie. Un paradoxe non résolu est que seuls certains agonistes des récepteurs 5-HT2A présentent une activité hallucinogène, alors que des composés de structure apparentée avec une affinité comparable au niveau du récepteur n'ont pas des propriétés psychoactives. En utilisant une approche quantitative phosphoproteomic combinant un marquage isotopique stable en acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC), un double enrichissement en phosphopeptides par chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) / chromatographie d'affinité (IMAC) et la spectrométrie de masse haute résolution, nous avons comparé les phosphoprotéome dans des cellules HEK-293 cellules exprimant de manière transitoire le récepteur 5-HT2A sous trois conditions: cellules non stimulées, cellules exposées aux hallucinogènes [2,5-diméthoxy-4-iodophényl]-2-aminopropane (DOI) et LSD les cellules exposées aux agonistes non- hallucinogènes Lisuride et Ergotamine. Parmi les 5996 phosphopeptides identifiés, 454 sont spécifiquement régulés par les hallucinogènes. Il s'agit notamment d'un résidu sérine du récepteur 5-HT2A éventuellement impliqués dans la régulation de la désensibilisation des récepteurs qui a été spécifiquement phosphorylée lors de l'exposition aux deux hallucinogènes. La phosphorylation différentielle des récepteurs 5-HT2A dans les cellules exposées aux agonistes hallucinogènes (DOI et le LSD) vs non hallucinogènes (lisuride et l'ergotamine) a été confirmé par l'analyse par spectrométrie de masse du récepteur purifié. Parallèlement, l'exposition des cellules aux agonistes hallucinogènes induit une internalisation et une désensibilisation des récepteurs moins prononcée qu'après exposition à la non-agonistes hallucinogènes. En conclusion, les résultats de cette thèse révèlent que la stimulation du récepteur 5-HT2A par les hallucinogènes et les agonistes non hallucinogènes induit deux modèles différents de phosphorylation qui pourraient être impliqués directement dans leurs réponses comportementales distinctes. ils fournissent également l'une des premières manifestations de la phosphorylation différentielle d'un récepteur couplé aux protéines G lors de la stimulation du récepteur par des agonistes biaisée.

The serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT)2A receptor has been identified as the primary target of psychedelic hallucinogens such as lysergic acid diethylamide (LSD), which reproduce some of the core symptoms of schizophrenia. A non-resolved paradox is that only some 5-HT2A receptor agonists exhibit hallucinogenic activity, whereas structurally related compounds with comparable affinity and agonist activity lack psychoactive properties. Using a quantitative phosphoproteomic approach combining stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC), phosphopeptide enrichment by hydrophilic interaction chromatography (HILIC) / immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and high resolution mass spectrometry, we compared the phosphoproteome in HEK-293 cells transiently expressing the 5-HT2A receptor under three conditions: non-stimulated cells, cells exposed to the phenethylamine hallucinogen 1-[2,5-dimethoxy-4-iodophenyl]-2-aminopropane (DOI) and cells exposed to the non-hallucinogenic 5-HT2A agonist lisuride. Among the 5,996 identified phosphopeptides, 454 were specifically regulated by DOI but not by lisuride. These include a serine residue of 5-HT2A receptor possibly involved in regulation of receptor desensitization which was specifically phosphorylated upon DOI exposure. Differential phosphorylation of 5-HT2A receptor in cells exposed to hallucinogenic (DOI and LSD) vs. non-hallucinogenic (lisuride and ergotamine) agonists was further confirmed by mass spectrometry analysis of purified receptor. Correspondingly, cell exposure to hallucinogenic agonists induced a less pronounced receptor desensitization and internalization than exposure to non-hallucinogenic agonists. In conclusion, our phosphoproteomic analysis revealed that 5-HT2A receptor stimulation by hallucinogenic and non hallucinogenic agonists induces different phosphorylation patterns that might underlie their distinct behavioural responses. It also provides one of the first demonstrations of differential phosphorylation of a G protein-coupled receptor upon stimulation by biased agonists.