Microscopies de fluorescense et de diffraction super-résolues par éclairement multiple

par Jules Girard

Thèse de doctorat en Physique et sciences de la matière

Sous la direction de Anne Sentenac.

Le jury était composé de Anne Talneau, Emmanuel Fort.

Les rapporteurs étaient Laurent Cognet, Olivier Haeberlé.


  • Résumé

    Ce travail de thèse concerne l'amélioration du pouvoir de résolution de la microscopie optique en champ lointain. Nous avons développé des techniques qui tirent profit de la relation liant le champ électromagnétique émis par un objet à l’éclairement utilisé. En utilisant plusieurs images obtenues pour différents éclairements, et à l’aide d’un algorithme d'inversion approprié, il est possible d'accéder à des fréquences spatiales de l'objet habituellement filtrées par le microscope.Ce concept est d’abord appliqué à une technique de microscopie cohérente : la tomographique optique de diffraction. Elle permet d’obtenir numériquement une carte quantitative de la permittivité diélectrique de l'objet, avec une résolution supérieure à celle d'un microscope classique, à partir de plusieurs hologrammes de l'échantillon. Dans ce cadre, nous montrons que le phénomène de diffusion multiple permet d’atteindre des résolutions encore plus spectaculaires s’il est pris en compte. Nous étudions ensuite la microscopie de fluorescence par éclairement structuré, que nous proposons d’améliorer de deux manières différentes. Dans la première, nous utilisons un algorithme d’inversion capable de retrouver simultanément la densité de fluorescence et les éclairements utilisés. Grâce à celui-ci, nous pouvons remplacer l’illumination périodique et contrôlée généralement utilisée, par des speckles aléatoires formés avec un montage remarquablement simple. Nous montrons expérimentalement l'efficacité de cette approche. Dans un second temps, nous proposons de remplacer la lamelle de verre sur laquelle est repose l’échantillon par un réseau diélectrique nanométrique. Celui-ci crée à sa surface une grille de lumière de période inférieure à la limite de diffraction, ce qui permet d’améliorer d’avantage la résolution finale de l’image reconstruite. Nous détaillons la conception, la fabrication et la caractérisation expérimentale de ce substrat nanostructuré.


  • Résumé

    This PhD work focuses on the resolution improvement of far-field optical microscopy. We have studied and developed different techniques that take advantage of the relationship between the sample, the illumination and the diffracted (or emitted) field, in order to increase final band-pass of the image beyond that imposed by the diffraction phenomenon. In In these approaches, several images of the same sample are recorded under different illuminations. An inversion algorithm in then used to reconstruct a super-resolved map of the sample from the set of measurements.This concept is first applied to coherent microscopy. In tomographic diffraction microscopy, many holograms of the same unstained sample are obtained under various incidences, then used to numerically reconstruct a quantitative map of permittivity of the sample. The resolution is usually better than that of classical wide-field microscopy. We show theoretically and experimentally that, far from being a drawback, the presence of multiple scattering within the sample can, if properly accounted for, lead a to an even better resolution.We then study structured illumination fluorescence microscopy. We present two different ways for improving this method. The first one takes advantage of an inversion algorithm, which is able to retrieve the fluorescence density without knowing the illumination patterns. This algorithm permits one to replace the periodic light pattern classically used in structured illumination microscopy by unknown random speckle patterns. The implementation of the technique is thus considerably simplified while the resolution improvement remains. In the second approach, we propose to replace the coverslip on which the sample usually lays, by a sub-lambda grating. The latter is used to form, in near field, a light grid with sub-diffraction period that is able to probe the finest details of the sample. The design, fabrication and optical characterization of this key structure are detailed.


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