Impact des composantes cellulaires de la leucémie lymphoïde chronique de type B dans les rechutes post-thérapeutiques : de la Side population leucémique aux cellules immunitaires

par Emilie Gross

Thèse de doctorat en Cancérologie

Sous la direction de Anne Quillet-Mary.

Soutenue en 2010

à Toulouse 3 .

mots clés

• Leucémie Lymphoïde Chronique de type B
• Side Population
• Chimiorésistance
• Reconstitution immunitaire
• Leucémie lymphoïde chronique -- Thérapeutique
• Immunothérapie

Résumé

La Leucémie Lymphoïde Chronique de type B (LLC-B) est définie par l'expansion clonale de lymphocytes B malins de phénotype mature au niveau des compartiments sanguin, médullaire et ganglionnaire. Ce cancer atypique, caractérisé par l'accumulation sanguine de lymphocytes quiescents, présente un potentiel prolifératif concentré au niveau des ganglions dans la fraction leucémique des centres prolifératifs. Ces particularités uniques de la LLC-B rendent énigmatique son processus de leucémogenèse et justifient l'absence de preuves expérimentales concernant la hiérarchisation du clone LLC-B. Au niveau clinique, la résurgence constante et invariable du clone leucémique post-thérapie fait de la LLC-B une maladie incurable. La compréhension de l'hétérogénéité cellulaire à la base de la chimiorésistance et l'élaboration d'options thérapeutiques alternatives sont essentielles pour éradiquer durablement le clone leucémique. Devant l'inhérente inefficacité des protocoles thérapeutiques actuels, l'immunothérapie constitue une approche alternative et prometteuse. Cependant, l'efficience des stratégies d'immunothérapie est dépendante de la rupture préalable des dialogues immunosubversifs qui existent entre cellules leucémiques et acteurs de la surveillance anti-tumorale. Dans ce contexte, la chimiothérapie a le potentiel de reverser les phénomènes d'immunosélection mis en place par les cellules tumorales. Dans la LLC-B, nous montrons qu'en plus d'une survie privilégiée des populations NK, le protocole FCR (Fludarabine Cyclophosphamide Rituximab) restaure les capacités cytotoxiques naturelles des lymphocytes du sang périphérique (PBL), qui se retrouvent amplifiées par la présence de Rituximab. Néanmoins, en présence d'une maladie résiduelle évolutive caractérisée par un taux élevé de cellules CD4+, la fonction des cellules NK apparaît inhibée, laissant présager l'occurrence d'évènements immunosélectifs précoces post-thérapie. Bien que le contrôle immunologique des cellules en rechute constitue un paramètre important, l'élucidation de l'hétérogénéité cellulaire, qui permet à une population leucémique d'échapper à l'effet cytotoxique des thérapies, reste fondamentale. Afin d'étudier cette base cellulaire de la chimiorésistance, nous avons utilisé le phénotype Side Population (SP) pour définir une nouvelle hétérogénéité intra-clonale des cellules de LLC-B du sang périphérique. Présent avant thérapie et amplifié dans des échantillons post-thérapeutiques, le compartiment mineur SP récapitule les caractéristiques phénotypiques et cytogénétiques du clone leucémique. De plus, les traitements Fludarabine et Bendamustine in vitro permettent de sélectionner exclusivement les cellules pourvues d'un phénotype SP ABCG2+BMI-1+. Incidemment, cet enrichissement implique en partie l'acquisition du phénotype SP par une proportion mineure de cellules non-SP sous pression chimiothérapeutique. La prolifération du compartiment SP trié ou obtenu par sélection chimiothérapeutique permet la reconstitution partielle du compartiment majoritaire non-SP. Ces données suggèrent, à l'aide de conditions prolifératives non physiologiques, le potentiel des cellules SP à participer à l'expansion du clone leucémique post-thérapie. En perspective, le ratio effecteurs/cibles favorable post-thérapie ainsi que la restauration des fonctions cytotoxiques PBL combinés à la chimiorésistance de la fraction SP, suggèrent fortement le potentiel thérapeutique de l'immunomodulation NK.

Titre traduit

Impact of B-cell chronic lymphocytic leukemia cell components in post-therapeutic relapses : from leukemic chemoresistant side population to immune cells

Résumé

B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) is defined by the clonal expansion and accumulation of malignant B lymphocytes in blood, bone marrow and lymph node compartments. This atypical cancer, characterized by peripheral blood accumulation of quiescent lymphocytes, displays a proliferative potential concentrated within the proliferative centers, in the lymph nodes. This unique feature of B-CLL renders elusive its leucemogenesis mechanisms and justifies the current lack of scientific evidences regarding hierarchy of the leukemic clone. In the clinic, the constant and invariable resurgence of the leukemic clone post-therapy makes B-CLL an incurable disease. Elucidation of the cellular heterogeneity mediating chemoresistance as well as the elaboration of novel therapeutic options are essential to eradicate durably the leukemic clone. As a result of the inherent inefficiency of current therapeutic regimens, immunotherapy constitutes a promising and alternative therapeutic approach. However, efficacy of immunotherapeutic strategies are highly dependant on preliminary disruption of immunosubversive dialogues between leukemic cells and actors of anti-tumor immunity. In this context, chemotherapy has the potential to reverse the immunoselection phenomenon engendered by tumor cells. In B-CLL, we show that, in addition to a selective survival of NK cells, the FCR protocol (Fludarabine Cyclophosphamide Rituximab) restores natural cytotoxic capacities of peripheral blood lymphocytes (PBL), which can be further enhanced by Rituximab implementation. Nevertheless, in the case of evolving minimal residual disease (MRD) characterized, here, by high CD4+ cells levels, NK function appeared inhibited, suggesting the occurrence of early immunoselective events post-therapy. Although immunological control of disease relapse remains an important parameter, unraveling the cellular heterogeneity that allows a specific leukemic population to escape cytotoxic effects of therapies, remains crucial. With the aim of uncovering this cellular basis of chemoresistance, we used the Side Population (SP) phenotype in order to define a new intra-clonal heterogeneity of B-CLL cells from peripheral blood. Present before therapy and amplified in post-therapeutic samples, the minor SP compartment recapitulates phenotypic and cytogenetic characteristics of the B-CLL clone. Furthermore, in vitro Fludarabine and Bendamustin treatments select exclusively leukemic cells harboring the SP phenotype. At the cell level, this enrichment involves partially the acquisition of the SP phenotype by a minor proportion of non-SP cells under chemotherapeutic pressure. Proliferation of sorted or chemotherapy-induced SP cells allow partial reconstitution of main non-SP compartment. These data suggest, with a non physiological proliferative trigger, the potential of SP cells to promote expansion of the leukemic clone post-therapy. In perspective, the favorable effector/target ratio post-therapy and the increased cytotoxic function of PBL combined to the chemoresistance strongly suggest the therapeutic potential of NK immunomodulation.