Rôle du compartiment endosomal dans la cytotoxicité de trois toxines hétérodimériques AB : la toxine diphtérique, l'exotoxine A de pseudomonas aeruginosa et la toxine du choléra
par Tatiana El Hage
Thèse de doctorat en Microbiologie
Sous la direction de François Authier.
Soutenue en 2010
à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté de pharmacie (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine) (autre partenaire) .
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Résumé
Les toxines AB sont des toxines hétérodimériques d’origine bactérienne ou végétale constituées de deux sous unités: la sous-unité B liante qui permet l’interaction de la toxine avec la cellule infectée ; et la sous-unité A catalytique qui exerce l’activité cytotoxique. Les toxines AB natives sont synthétisées sous la forme dimérique inactive et requiert au moins un clivage protéolytique et/ou réductionnel par des systèmes enzymatiques cellulaires afin de libérer la sous-unité catalytique A sous la forme monomérique cytotoxique. Afin d’atteindre leur cible protéique localisée dans le compartiment cytoplasmique, les toxines AB sont internalisées selon différentes voies d’endocytose puis s’accumulent dans le compartiment endosomal, un site subcellulaire majeur de concentration et d’activation. Notre objectif principal a été de déterminer le rôle du processus d’endocytose et de l’endosome dans l’activation et la cytotoxicité des toxines AB afin d’identifier des cibles thérapeutiques lors des toxi-infections principalement au niveau des cellules hépatiques. Les toxines étudiées ont inclus trois toxines d’origine bactérienne: la toxine du choléra (TC), la toxine diphtérique (TD) et l’exotoxine A de Pseudomonas aeruginosa (EA). L’approche expérimentale a fait appel à un modèle in vivo chez le rongeur injecté par les toxines, à des systèmes cellulaires traités par les toxines ainsi qu’à des systèmes purement in vitro. Parmi nos résultats, nous avons montré une dégradation endosomale des trois toxines sous la dépendance de l’acidification de l’endosome controlée par l’activité des H+-ATPase membranaires. La protéase à acide aspartique cathepsine D (TC, TD et EA) et la protéase à cystéine cathepsine B (EA) ont été identifiées comme responsables de la protéolyse des toxines à pH acide, tandis qu’une nouvelle forme tronquée de la furine de 70-kDa était responsable de la protéolyse de la TD à pH neutre. La cytotoxicité des fragments de toxine générés dans l’endosome hépatique a été mesurée vis-à-vis de leur cible cytoplasmique par des réactions d’ADPribosylation de la protéine Gsα (TC) ou du facteur d’élongation EF2 (TD, EA). Les fragments générés à pH acide ont montré une capacité ADPribosyltransférase importante pour TC et EA, mais fiable pour TD, tandis que ceux générés à pH neutre ont révélé une cytotoxicité importante pour TD. Finalement, l’analyse de l’association des toxines au compartiment cytoplasmique a révélé la présence des sous-unités A de TC et EA, mais l’absence de TD. La translocation des toxines internalisées de l’endosome vers le cytoplasme a été évaluée par l’utilisation d’un système acellulaire d’endosomes chargés en toxine in vivo et incubés in vitro en conditions isotoniques. Une traversée de la membrane endosomale de EA et de ses fragments qui requiert l’acidification de l’endosome a été établie, tandis qu’une translocation de Td n’a pu être identifiée. La rétention endosomale de TD trouverait son origine dans le dysfonctionnement du système de translocation Hsp90/thiorédoxine réductase-R1 de la TD chez le rongeur, une espèce résistante à la diphtérie. En conclusion, nous avons identifié plusieurs systèmes enzymatiques associés aux endosomes qui participent aux étapes d’activation des toxines AB (protéases, système d’acidification, système de translocation) et représentent des cibles thérapeutiques lors des toxi-infections
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Titre traduit
The role of endocytic compartment in the cytotoxicity of three AB-toxins : diphtheriae toxin, exotoxin A of pseudomonas and the cholera toxin
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Résumé
Bacteria produce a large variety of protein toxins with intracellular targets. Such toxins include those that have two moieties, one (that B-moiety) that binds to cell surface receptors and another (A-moiety) with enzymatic activity that enters the cytosol. These toxins are so called the AB-toxins. They are initially produced as a single polypeptide chain. They need to be cleaved between the A and B subunits to release the active cytotoxic moiety A. Common to all these toxins, regardless of the target molecule, is that they have to enter the cytosol to exert their effects. They are internalized in many different endocytosis pathways and accumulate in the endocytic compartments. Our goal was to determine the role of the endocytosis and the endosomal compartment in the activation and the cytotoxic activity of the AB toxins, in order to identify new therapeutical tools when a toxi-infection occurs especially in hepatic cells. The studied toxins are: the diphtheria toxin (TD), Pseudomonas exotoxin A (EA) and the cholera toxin (TC). The methodology used is an in ivo rodent liver model of rat injected with the toxins followed by a subcellular fractionation approach and pure in vitro protease assays. Our results showed an endocytic proteolysis of the three toxins depending on the acidity of the endosomal compartment controlled by the ATPase-H+ pump. The aspartic acid protease cathepsin D (TC, TD and EA) and the cystein protease cathepsin B (EA) were identified as responsible for the proteolysis of these toxins at a low pH. However a new form of furin of 70-kDa was responsible of the proteolysis of TD at neutral pH. The cytotoxicity of the fragment delivered in the hepatic endosome was measured by radioactive ADP-ribosylating reactions of their target molecules – of the Gsα (TC) and of the elongation factor EF-2 (TD, EA). The fragments generated at acidic pH showed an important ADPribosylating activity of TC and EA, however less important for TD. Finally the analysis of the fragments found in the cytoplasmic compartment has revealed the presence of the two subunits A of TC and EA. However the cytotoxic subunit of TD was not detected. Using cell-free hepatic endosomes, we established that EA and its fragments translocate from the endosome to the cytosolic compartment depending on the acidification of the endosome while the translocation of TD was not identified. The fact that TD wasn’t able to translocate through the endosomal membrane could be explained in the dysfunction of the translocation system Hsp90/thioredoxin reductase-R1 in the rat, resistant specie to the toxi-infection of TD. To conclude, we have identified many enzymatic systems found in the endosomal compartment which participate in the activation of the toxins AB (proteases, acidification system, and translocation system) and represent a novel therapeutic target when toxin infection occurs.
