Tar1 : un gène hébergé sur le brin antisens de l'ADN ribosomique de Saccharomyces cerevisiae, code une protéine mitochondriale

par Aurélie Galopier

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Génétique

Sous la direction de Sylvie Hermann-Le Denmat.

Soutenue en 2010

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• ADN ribosomique
• Gène antisens
• Mitochondries

Résumé

Mon projet de thèse a porté sur l'étude fonctionnelle du gène TAR1. Ce gène est localisé sur le brin antisens de l'ADNr 25S de Saccharomyces cerevisiae et code un polypeptide (Tar1p), de fonction inconnue, localisé dans les mitochondries. Je me suis intéressée au transcrit TAR1 afin d'en déterminer les extrémités 5' et 3'. Grâce à un système rapporteur que j'ai construit, j'ai étudié l'expression de TAR1 dans différentes conditions de culture. J'ai mis en évidence que Tar1p est localisée dans la membrane interne des mitochondries avec son extrémité amino-terminale localisée du coté matriciel et son extrémité carboxy-terminale dans l'espace intermembranaire. Une séquence clivable, non essentielle pour la localisation de la protéine dans les mitochondries, semble être présente dans les 32 derniers acides aminés. J'ai également détecté Tar1p dans les mitochondries de la levure Kluyveromyces lactis mais pas dans celles de Schizosaccharomyces pombe. Je me suis ensuite intéressée à l'inactivation du gène TAR1. Etant donné que le gène TAR1 est répété un grand nombre de fois dans le génome, une délétion classique par inactivation de l'ORF n'est pas réalisable. J'ai donc entrepris d'inactiver l'expression de la protéine Tar1p dans une souche sauvage de levure par deux techniques différentes. L'une est basée sur l'utilisation de snoARNs à boîtes C/D. L'idée étant de méthyler spécifiquement le transcrit TAR1 dans l'optique d'altérer la traduction de ce gène et donc la production de la protéine dans la cellule. L'autre est réalisée par introduction de codons stop dans la phase ouverte de lecture TAR1 dans une souche de levure contenant une seule unité d'ADNr portée par un plasmide.

Titre traduit

Tar1 : a gene localized on the antisense strand of the ribosomic DNA of yeast Saccharomyces cerevisiae, encodes a mitochondrial protein

Résumé

My PhD project focused on functional study of the TAR1 gene. TAR1 is localized on the antisense strand of the 25S rDNA of yeast Saccharomyces cerevisiae and encodes a polypeptide (Tar1p) of unknown function, which localized into mitochondria. First, I was interested to the TAR1 transcript to identify its 5' and 3' ends. Using a reporter system I set up, I studied the expression of TAR1 in various conditions. Then I have demonstrated that Tar1p is localized in the inner membrane of mitochondria with its amino-terminal end in the matrix and its carboxy-terminal end in the intermembrane space. The last 32 amino acids appear to be cleavable but this sequence is not essential for the protein import into mitochondria. I detected the endogenous Tar1p polypeptide in mitochondria of the yeast Kluyveromyces lactis but not of Schizosaccharomyces pombe. Secondly, I tried to inactivate TAR1. However, due to the high copy number of this gene in the genome, it was not possible to use classical deletion approach. I developed two approaches to inactivate TAR1. The first one is based on the use of C/D snoRNAs. SnoRNAs were constructed to target the methylation of one nucleotide within the TAR1 mRNA. One may expect that this methylation will interfere with mRNA translation. The second one is to introduce stop codons within the open reading frame of TAR1 in a yeast strain containing a single plasmidic unit of rDNA. These stop codons are expected to stop translation, preventing the synthesis of Tar1p.