Structure, function and regulation of the nitrate/proton transporter AtCLCa in arabidopsis thaliana

par Stefanie Wege

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Science du végétal

Sous la direction de Sophie Filleur.

Soutenue en 2010

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Nitrates
• Arabidopsis thaliana
• Phosphorylation

Résumé

AtCLCa chez Arabidopsis thaliana appartient à la famille de transporteurs d’anions appelés ‘ChLoride Channel’ (CLC). AtCLCa est plus sélectif pour le nitrate que pour le chlorure. C’est un antiporteur NO3-/H+ à l’origine de l’accumulation du nitrate dans la vacuole. La différence de sélectivité est due à un simple changement d’un acide aminé. Nous avons pu montrer que le changement de cet acide aminé transforme AtCLCa en un transporteur de chlorure et est incapable de réaliser sa fonction dans l’accumulation de nitrate dans la vacuole in planta. De plus, nous avons démontré que AtCLCa est directement régulé par la liaison de l’ATP et que cet effet est influencé par le rapport ATP/AMP, l’AMP supprimant l’effet de l’ATP. Ceci suggère que la régulation de AtCLCa est dépendante du statut énergétique de la cellule. En supplément, nous avons aussi montré que cette protéine est régulée par phosphorylation dans sa partie N-terminale. Nous avons identifié une classe de protéines, les SnRKs, qui sont capables de phosphoryler AtCLCa in vitro et d’interagir avec AtCLCa in vivo. SnRK1. 1 et SnRK2. 6. SnRK1. 1 est exprimée de manière ubiquitaire dans la plante et peut inhiber l’activité de la nitrate réductase. Des études d’expression GUS montrent que AtCLCa est exprimé au travers de la plante (comme SnRK1. 1) mais une forte expression observée dans les cellules de garde comme pour SnRK2. 6. Des analyses phénotypiques des mutants nuls clca démontrent la fonction de AtCLCa non seulement dans l’accumulation du nitrate mais aussi dans les mouvements stomatiques. Ces résultats suggèrent une possible interaction dans les cellules de garde de la kinase SnRK2. 6 et ATCLCa in planta.

Résumé

The Arabidopsis thaliana CLCa belongs to the ChLoride Channel (CLC) family of anion transport proteins. AtCLCa is most selective for nitrate and not for chloride. It mediates the accumulation of nitrate into the vacuole by a NO3-/H+ exchanger mechanism. The difference in selectivity is accompanied by a single amino acid difference. We could show that an exchange of this amino acid turns AtCLCa into a chloride transporter and abolishes its function of nitrate accumulation in planta. Furthermore, we could show that AtCLCa is directly regulated by ATP and that this effect is influenced by the ATP/AMP ratio, as AMP abolished the effect of ATP, suggesting an energy-state dependent regulation of AtCLCa in the cell. Additionally to the regulation of AtCLCa by nucleotides, we could also show that it is regulated by phosphorylation on its N-terminus. We identified a specific class of kinases, the SnRKs, which are able to phosphorylate AtCLCa in vitro and interact with it in vivo. We focused on two candidate kinases within this family, SnRK1. 1 and SnRK2. 6. SnRK1. 1 can inhibit the nitrate reductase. Therefore, the activity of SnRK1. 1 is connected to nitrate metabolism, like the activity of AtCLCa. SnRK2. 6 is strongly expressed in stomata guard cells and GUS expression studies showed that AtCLCa is expressed throughout the plant (like SnRK1. 1), but shows a particular high expression in stomata guard cells like SnRK2. 6. Subsequent phenotype analyses of clca knock-out mutants demonstrated a role of AtCLCa not only in nitrate accumulation but also in stomata movement, suggesting a possible interaction of the guard cell kinase SnRK2. 6 and AtCLCa in planta.