Purification et caractérisation d'une nouvelle peroxydase extraite de l'ail et son application en tant que biocapteur électrochimique pour l'analyse alimentaire et environnementale

par Sarra El Ichi

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Hafsa Korri-Youssoufi et de Mohamed Nejib Marzouki.

Soutenue en 2010

à Paris 11 en cotutelle avec l'Institut national des sciences appliquées et de technologie de Tunis , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Peroxydase
• Biocapteurs
• Polluants

Résumé

La nouvelle peroxydase (POX1B) extraite de l'Ail possède des propriétés biochimiques intéressantes par comparaison à HRP. En effet, elle est hautement active à pH acide et stable vis-à-vis de la température et de la conservation. Elle présente un pH optimum d'environ 5 et une température optimale de 30°C. L'enzyme conserve 70 % de son activité initiale à 60°C et une activité totale à 50 et 40°C après 40 min. Par la suite, l'étude de la relation structure-fonction a été réalisée en analysant les propriétés spectroscopiques ainsi que leur corrélation à la structure déterminée par une nouvelle génération de spectromètre de masse hybride à haute performance. Les études de la structure chimique ont montré que le groupement héminique de cette protéine est pentacoordiné et renferme une histidine comme ligand proximal. POX1B sous-forme native et reconstituée a montré une haute affinité vis-à-vis du peroxyde d'hydrogène ainsi que vis-à-vis d'une variété de co-substrats réducteurs. En plus, une haute spécificité de l'enzyme a été démontrée. Les valeurs de kcat/KM sont 413. 28, 403. 81 mM-1s-1 respectivement pour le TMB et l'ABTS. Par ailleurs, la réduction des composés nitrés en présence de POX1B a été démontrée par la formation de complexes Fe(II)-nitrosoalcanes. POX1B présente un grand potentiel d'application pour le métabolisme des médicaments puisqu'elle est capable de réagir avec le 1-nitrohexane en présence du dithionite de sodium comme ça a été démontré par l'apparition d'une bande de Soret caractéristique à 411 nm. En plus, l'efficacité catalytique de la nouvelle peroxydase extraite de l'Ail pourrait être exploitée pour la détection d'une variété d'analytes et en biocatalyse. L'enzyme possède un bon potentiel d'application en tant que biorécepteur pour la détection électrochimique du peroxyde d'hydrogène et des polluants. L'immobilisation de l'enzyme a été réalisée en utilisant le chitosane comme biopolymère. Les essais électrochimiques ont montré que le biocapteur est capable de mesurer une concentration de H2O2 allant jusqu'à 100 nM en mode de détection directe. La limite de détection mesurée dans des échantillons de lait a été de 30 μM avec un temps de réponse inférieur à 1 min. Par la suite, l'activité électro-catalytique d'un second biocapteur à base de POX1B a été démontrée en présence de dérivés de chlorophénols avec des concentrations variant entre 10 pM et 10 μM. Le biocapteur construit avec POX1B et sans utilisation d'un médiateur a présenté une bonne sensibilité en présence du 2,6-dichlorophénol, du 4-chlorophénol et du pentachlorophénol. Une limite de détection de l'ordre de 1 pM a été mesurée dans le cas du 4-chlorophénol avec une constante cinétique Km,app de 0. 42 μM et un temps de réponse électrochimique rapide de l'ordre d'1 s.

Titre traduit

Purification and characterization of new garlic peroxidase and its application as electrochemical biosensor for food and environmental analysis

Résumé

A new peroxidase was purified from garlic bulbs (POX1B) with interesting biochemical properties compared to HRP. Ln fact, POX1B is highly active at acidic pH and stable vs. Temperature and storage. The optimal pH was around 5 and the optimal temperature was 30°C. Studies of the heat-stability demonstrated that almost 70 % of the initial activity was conserved at 60°C and full activity was retained at 50 and 40°C for 40 min. Then, the structure-function relationship was investigated by analysis of the spectroscopic properties and correlated to the structure determined by a new generation of high performance hybrid mass spectrometer. Studies of the chemical structure showed that the heme group of this protein is pentacoordinated and has a histidine as proximal ligand. Native and reconstituted POX1B exhibited high affinity towards hydrogen peroxide as well as various reducing co-substrates. Ln addition, high enzym specificity was demonstrated. The kcat/KM values were 413. 28, 403. 81 mM-1s-1 for TMB and ABTS, respectively. Furthermore, the reduction of nitro compounds in presence of POX1B was demonstrated by iron(II)-nitrosoalkane complexes assay. POX1B showed a great potential to be a lied for drug metabolism since its ability to react with 1-nitrohexane in resence of sodium dithionite was demonstrated by the appearance of a characteristic Soret band at 411 nm. Besides, the high catalytic efficiency obtained in the case of the new garlic peroxidase (POX1B is suitable for different analytes monitoring and biocatalysis). The enzyme has shown a good potential for electrochemical detection of hydrogen peroxide and chlorophenols. The enzyme immobilization was carried out using chitosan as biopolymer. Electrochemical assays showed that the biosensor was able to monitor H2O2 as low as 100 nM in direct detection mode. The measured detection limit was 30 μM in milk samples with a response time less than 1 min. Then, the electrocatalytic activity of a second POX1B-based biosensor towards chlorophenols derivatives in a large range from 10 pM to 10 μM was demonstrated. The mediator free POX1B based biosensor exhibited high sensitivity towards 2,6-dichlorophenol, 4-chlorophenol and pentachlorophenol. A detection limit of 1 pM in the case of 4-chlorophenol was demonstrated with kinetic constant Km,app of 0. 42 μM and high rapidity of electrochemical response of the biosensor of 1 s.