Molecular and cellular basis of Yellow fever virus entry into target cells

par Maria Dolores Fernandez Garcia

Thèse de doctorat en Microbiologie et virologie

Sous la direction de Ali Amara.

Soutenue en 2010

à Paris 7 .

mots clés

• Virus du Nil occidental
• Interactions hôte-pathogène
• Modèles biologiques
• Clathrine
• Pénétration virale

Titre traduit

Bases moléculaires et cellulaires de l'entrée du virus de la fièvre jaune dans les cellules cibles

Résumé

Cette travail a eu pour but caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires utilisés par le virus de la fièvre jaune (YFV) pour pénétrer dans les cellules de mammifères. La souche vaccinale contre la fièvre jaune 17D est un virus vivant atténue généré après de nombreux passages de la souche virulente Asibi sur tissus de poulet. Nous montrons que la forme atténuée présente une capacité infectieuse nettement supérieure à la souche sauvage et que cette différence d'infectivité est corrélée à une différence de voies d'entrée. En effet, les résultats obtenus par différentes techniques (inhibiteurs pharmacologiques, RNAi, mutants) montrent qu'alors que la souche Asibi utilise la voie d'internalisation dépendante de la clathrine, la souche 17D emprunte une voie d'endocytose indépendante de la clathrine et des caveolae mais dépendante de la dynamine. On montre que les mutations localisées dans glycoprotéine d'enveloppe virale de 17D seront les responsables de que cet virus utilise des routes d'endocytose distinctes a celles exploitées par Asibi fait qui corrèle avec le rôle essentiel accompli par cette protéine dans la internalisation du virus. Pour identifier des facteurs cellulaires de la voie d'entrée empruntée par la souche 17D, un criblage à l'aide de RNAi a été réalisé en collaboration avec l'équipe de Lukas Pelkmans (Zurich). Un premier criblage ciblant certaines protéines kinases cellulaires a permis d'identifier DYRK3 comme facteur requis à l'infection, En plus, ce travail montre que l'ubiquitine ligase CBLL1 n'est pas nécessaire à l'infection par les flavivirus et que le système ubiquitine/proteasome joue un rôle dans la réplication génomique des flavivirus.

Résumé

The live, attenuated yellow fever virus (YFV) strain 17D vaccine (YFV17D) is one of the most effective vaccines ever made. The original 17D strain was developed following multiple passages of virulent wild-type strain Asibi in mouse and chicken tissue. In this study, we have generated new virological tools to investigate YFV entry and compared the endocytic routes exploited by wild-type Asibi and attenuated 17D vaccine in human cell Systems. We provided strong evidence that infectious entry program of YFV Asibi and 17D occurs through différent mechanisms. Interestingly, we observed that 17D enters and productively infect cells that are unable to take up ligands by clathrin-mediated endocytosis. Using a series of chemical inhibitors, expression of dominant negative form of Eps15, or siRNA silencing of the clathrin heavy chain -ail aimed at preventing CME- we demonstrated that while Asibi infection was abolished, YFV17D could enter and productively infect cells. These data provided the first evidence that YFV17D can utilize a clathrin-independent pathway; and that vaccine and wild type strains of YFV may enter and infect cells via distinct mechanisms. Using reporter virus like particles, we showed that the mutations located in YFV17D E protein are responsible for the clathrin-independent entry of the vaccine YFV strain. Finally, data obtained from a RNA interference screen identified the kinase DYRK3 and the ubiquitin proteasome System as putative host factors required for YFV17D infection. We validated this finding using different sets of RNAi and chemical inhibitors and presented experiments suggesting a common role of these cellular factors during flavivirus infection.