Translocation d'acides nucléiques au travers d'une bicouche lipidique : du nanopore au bactériophage

par Nicolas Chiaruttini

Thèse de doctorat en Interfaces Physique - Biologie

Sous la direction de Ulrich Bockelmann et de Virgile Viasnoff.

Soutenue en 2010

à Paris 7 .

mots clés

• Bactériophage lambda
• Nanotechnologie
• ADN
• Dénaturation d'acide nucléique
• Hémolysines
• Électroporation -- méthodes

Résumé

Ce travail porte sur l'étude expérimentale de deux mécanismes de translocations d'acides nucléiques au travers d'une membrane lipidique : la translocation, forcée électrophorétiquement, d'oligomères au travers d'un pore d'alpha-hémolysine et la translocation passive d'un ADN génomique hors de la capside du bactériophage T5. La première partie de la thèse porte sur l'ouverture de molécules d'ADN double brin à travers le nanopore d'alpha hémolysine. Les temps de passage individuels de molécules d'ADN à travers le pore sont mesurés expérimentalement en fonction de la séquence, de la longueur et de la force appliquée sur l'ADN. Les distributions obtenues sont confrontées à un modèle décrivant le passage de l'ADN par la diffusion d'une fourche d'ouverture dans un paysage énergétique unidimensionnel, déterminé par la séquence de la molécule. La deuxième partie porte sur un système in vitro reconstituant les étapes initiales d'infection du bactériophage T5. L'interaction de T5 avec son récepteur membranaire FhuA purifié en détergent, génère une séquence d'événements qui conduit à l'éjection du génome viral hors de la capside : (i) fixation du récepteur ; (ii) activation conduisant à l'ouverture d'un canal d'ADN ; (iii) éjection de l'ADN. La dynamique des trois étapes est mesurée à l'aide d'expériences en population et en virus unique. La dernière étape est comparée à un modèle physique qui révèle une dynamique fortement hors d'équilibre à l'initiation de l'éjection. Enfin, FhuA est reconstitué dans des vésicules lipidiques géantes afin de suivre l'éjection par microscopie de fluorescence et par électrophysiologie à travers une membrane lipidique.

Titre traduit

Nucleid acid translocation through a lipid membrane : from nanopore to bacteriophage

Résumé

This work highlights two nucleic acid translocation mechanisms through a lipid membrane: first the electrophoretically driven translocation of oligomers through alpha-hemolysin nanopore, then the passive translocation of genomic DNA outside T5 bacteriophage capsid. The first part of this thesis focuses on double-stranded DNA molecules unzipping through the alpha-hemolysin nanopore. The translocation time of single molecules through the pore are experimentally measured as a fonction of DNA sequence, DNA length and the applied force. Distributions obtained are compared with a model describing DNA translocation as a diffusion of an opening fork in a 1D energy landscape determined by the sequence of the molecule. The second part deals with an in vitro System reconstituting the initial steps of bacteriophage T5 infection. The interaction of T5 with its detergent purified membrane receptor FhuA generates a sequence of events leading to the release of the viral genome out of the capsid: (i) receptor binding, (ii) activation leading to the opening of a DNA channel, (iii) DNA release. The dynamics of the three steps is measured using both bulk and single virus assays. The DNA release step is compared to a physical model which exhibits a largely out of equilibrium dynamics. Finally, FhuA is reconstituted into giant lipid vesicles to monitor the ejection through a lipid membrane using fluorescence microscopy and electrophysiology.