Etudes structurales et fonctionnelles des complexes pr-E des virus de la fièvre jaune vaccinale et sauvage

par Eric Crampon

Thèse de doctorat en Interfaces Physique - Biologie

Sous la direction de Félix Rey.

Soutenue en 2010

à Paris 7 .

mots clés

• Virus de la fièvre jaune
• Protéines de l'enveloppe virale
• Fusion membranaire
• Dichroïsme circulaire
• Cristallisation

Titre traduit

Structural and functional studies of Pr-E complexes of yellow fever viruses

Résumé

Les virus enveloppés entrent dans les cellules par fusion membranaire, mécanisme qui permet la libération de leur génome dans le cytosol de leur hôte. Le virus de la fièvre jaune est le virus de référence des Flavivirus, famille de virus enveloppés à ARN simple brin de polarité positive. Malgré un vaccin efficace fondé sur une souche atténuée (17D), ce virus cause encore à l'heure actuelle 200 000 contaminations et 30 000 morts chaque année dans les régions subtropicales d'Afrique et d'Amérique du Sud. La protéine d'enveloppe E est impliquée dans deux phénomènes précoces du cycle viral, la liaison au récepteur et la fusion membranaire. C'est pourquoi cette protéine est une cible majeure pour le développement de nouveaux antiviraux et que nous avons cherché à déterminer sa structure cristallographique. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires de l'atténuation du vaccin, nous avons travaillé avec la souche vaccinale 17D-204 et la souche sauvage parentale Asibi. En effet, ces deux souches ne diffèrent que par 12 mutations dans la protéine d'enveloppe, et nous désirions comparer les structures de ces deux protéines. Alors que nous attendions à ne produire que la protéine d'enveloppe, nous avons pu purifier et cristalliser le complexe immature constitué de pr (ectodomaine soluble résultant du clivage de prM en pr +M par la furine) et de l'ectodomaine de E, des souches 17D-204 et Asibi. Après dissociation du complexe, nous avons donc pu caractériser les constantes d'affinités, les déterminants thermodynamiques et fonctionnels de ce complexe. Dans leur ensemble, ces données ouvriront de I nouvelles perspectives dans le développement d'inhibiteur de la fusion membranaire des Flavivirus.

Résumé

Enveloped viruses enter cells by membrane fusion, a mechanism that allows the release in the cytoplasm of the infected cell of their genome. Yellow fever virus is the reference virus for Flavivirus, family of enveloped positive single strand RNA viruses. In spite of an efficient vaccine based on an attenuated strain (17D), this virus still causes 200,000 infections per year with 30,000 deaths, mainly in African and South American subtropical areas. Envelope protein E plays a role in two early phenomena of virus cycle, acting during virus entry for receptor recognition and binding, and during membrane fusion. This is the reason why this protein is the main target for the development of new antivirals. We were so interested in determining the crystal structure of this major pathogen antigen. Wild-type Asibi strain and vaccinal 17D-204 strain only differ one of the other by 32 mutations in the whole polyprotein, 12 of them within E protein. To better I understand molecular mechanisms of the vaccine attenuation, we crystallized both proteins from the wild-type and vaccinal strains. With our expression System, we were expecting to produce only the envelope E protein, as it was experienced for other Flaviviruses. But surprisingly, we co-purified and co-crystallized the immature complex of the virus, consisting in pr result of the cleavage of prM as pr + M by the furin) and E, for both Asibi and 17D-204 strains. After dissociation of the complex, we successfully determined affinity I constants, thermodynamical and functionnal characteristics of the complex. Overall, these results can lead to the development of new fusion inhibitors against Flavivirus.