Mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de qualité de la protéine NKCC2

par Nancy Zaarour

Thèse de doctorat en Physiologie et physiopathologie

Sous la direction de Pascal Houiller.

Soutenue en 2010

à Paris 6 .

mots clés

• Trafic des protéines NKCC2
• Dégradation associée au RE
• Os-9
• Maturation
• Motif de transport
• Syndrome de Bartter

Résumé

Le rein et plus particulièrement la BLA intervient d’une manière primordiale dans l’homéostasie hydro-électrolytique et acido-basique de l’organisme, principalement par le biais du cotransporteur NKCC2. La mutation de ce dernier induit le syndrome de Bartter (BS type 1), une tubulopathie rénale qui s’exprime par une perte rénale de chlorure de sodium, une alcalose hypokaliémique et une hypercalciurie. Cependant, malgré l’importance de NKCC2 dans la fonction rénale, les mécanismes moléculaires régulant son expression sont peu connus. Le but de ces travaux de thèse était d’identifier les déterminants moléculaires impliquées dans la régulation du trafic intracellulaire de NKCC-2, plus précisément dans la régulation du cotransporteur par le système de contrôle de qualité associé au réticulum endoplasmique (ERAD). Dans la mesure où le domaine C-terminal de NKCC2 est la principale région cytoplasmique de cette protéine, il est vraisemblable qu’elle soit un facteur essentiel dans le contrôle du trafic du cotransporteur. Ainsi, dans un premier temps, nous avons criblé une banque d'ADNc de rein humain en utilisant comme appât le domaine C-terminal de NKCC-2. Parmi les différents clones positifs identifiés, plusieurs contiennent des séquences chevauchantes de OS-9, une protéine précédemment identifiée comme facteur clé dans la régulation de la stabilité des protéines. Les expériences de co-immunoprecipation dans les cellules rénales ont révélé qu’OS-9 interagit principalement et spécifiquement avec la forme immature de NKCC2. De plus, une analyse par immunofluorescence montre une colocalisation entre OS-9 et NKCC2 au niveau du RE. La co-expression d’OS-9 augmente la polyubiquitination et la dégradation de la forme immature du cotransporteur diminuant ainsi l’expression membranaire de NKCC2, un effet abolit par l’adjonction de MG132, un inhibiteur de la voie de dégradation protéique par le proteasome. L’ensemble de ces arguments suggèrent fortement qu’OS-9 fait partie des composantes clés et spécifiques du système ERAD de NKCC2. Une meilleure compréhension de système ERAD de NKCC2 via l’identification de composants spécifiques modulant la régulation de NKCC2 pourrait à long terme aboutir à des nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement du syndrome de Bartter du type 1. Le deuxième volet de ce travail a porté sur l’identification des déterminants moléculaires intrinsèques impliqués dans la maturation de NKCC2. Nos résultats montrent que la délétion de la partie distale de l’extrémité COOH-terminale de NKCC2 abolit la maturation et la glycosylation de la protéine. Une analyse approfondie de cette région a permis d’identifier un motif composé de trois acides aminés hydrophobes LLV comme signal d’export de NKCC2 du RE vers les appareils de Golgi. De plus, nos résultats démontrent que toutes les mutations de Bartter du type 1 interférant avec ce motif préviennent la maturation de NKCC2 provoquant ainsi sa rétention dans le RE et donc l’absence de son expression et de son activité du transport au niveau membranaire. Plus encore, notre étude a révélé que ce motif tri-hydrophobe est hautement conservé parmi tous les membres de la famille des co-transporteurs cation-chlore (CCC: NKCC, NCC, KCC) fournissant ainsi un mécanisme moléculaire commun impliqué dans le trafic de ces co-transporteurs. En conclusion, ces observations suggèrent que l’absence de ce motif hautement conservé parmi les CCC pourraient être à l’origine de différentes tubulopathies rénales étroitement liées non seulement à NKCC2 mais aussi aux autres membres des co-transporteurs CCC.

Titre traduit

Molecular mechanisms involved in quality control of NKCC2 protein

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