Micro-manipulation de l'ADN : vers une visualisation directe par microscopie de fluorescence

par Adrien Meglio

Thèse de doctorat en Interfaces Physique - Biologie

Sous la direction de Vincent Croquette.

Soutenue en 2010

à Paris 6 .

mots clés

• Biophysique
• Molécule unique
• ARN polymérase
• Ftsk
• Microscopie
• Pinces magnétiques

Résumé

Dans ce travail, nous proposons un nouvel appareillage, destiné à aider à la détermination du mécanisme de certaines protéines. Cet outil, qui combine un appareil de pinces magnétiques, et un microscope de fluorescence en ondes évanescentes, a été conçu pour pemettre à la fois la manipulation mécanique et l'observation de l'activité d'ADN translocases à l'échelle de la molécule unique. Nous présentons d'abord ici la conception, la réalisation et l'expérimentation de ce montage. Nous montrons que, d'une part, il se compare favorablement à ses composants séparés (pinces magnétiques et microscope de fluorescence), et que d'autre part leur réunion dans un appareil unique permet d'obtenir des résultats d'un type nouveau. Nous avons orienté l'étude des ADN translocases avec cet appareil sur l'exemple de deux protéines : le moteur FtsK de \coli et l'\trnap. Nous détaillons dans cette étude les questions importantes encore en suspens concernant le mécanisme et présentons les expériences que nous avons envisagées pour y répondre. Nous relatons ensuite également la difficulté que nous avons rencontrée à obtenir des substrats protéiques adaptés aux expériences que nous avons envisagées, et les solutions que nous avons mises en oeuvre pour y remédier. Enfin, nous analysons les résultats obtenus dans des expériences en volume ou en pinces magnétiques seules, qui ont permis de mettre en valeur de nouveaux comportements et de préparer la réalisation de nouvelles expériences sur notre montage combiné.

Titre traduit

DNA micromanipulation : en route to direct visualization by fluorescence microscopy

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