Caractérisation de la réponse yH2AX induite par les rayons ultra-violets pendant la phase de réplication

par Sébastien de Féraudy

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire (DNA Repair)

Sous la direction de Jean-Claude Weill.

Soutenue en 2010

à Paris 5 .

mots clés

• Immunologie
• Rayonnement ultraviolet
• Cytologie
• Ataxie-télangiectasie
• Biologie moléculaire
• Rayons gamma
• Réparation de l'ADN
• effets des radiations

Résumé

Le travail présenté ici est une investigation de la réponse aux dommages à l’ADN induite par les rayons ultra-violets (UV), et plus particulièrement de la réponse H2AX induite par les UV pendant la phase de réplication de fibroblastes humains. Pendant la phase de réplication, les rayons UV induisent la phosphorylation de la serine 138 de l’histone H2AX (γH2AX), soit sous la forme de foci, soit de facon diffuse, hyperintense, dans tout le noyau cellulaire (pan-nucleaire). La détection en immunofluorescence de γH2AX sous forme de foci est utilisé comme mesure directe du nombre de cassures double brin de l’ADN. En effet, les foci de γH2AX peuvent etre induits expérimentalement directement par les rayons ionisants, ou indirectement par l’inhibiteur de la toposiomerase 2 (VP16) et après irradiation UV par rupture des fourches de réplication bloquées par les dimères de thymidines. De plus, la co-localisation des foci de γH2AX avec 53BP1, un autre marqueur de cassure double brin de l’ADN, est observée après irradiation ionisante et traitement par le VP16 à l’emplacement des cassures double brin. Après irradiation UV cependant, la réponse γH2AX est plus complexe qu’après irradiation ionosante. Ainsi, le pourcentage des foci de γH2AX indiquant la présence de cassures double brin de l’ADN reste indeterminé. Par ailleurs, la genèse et la fonction de la forme diffuse, hyperintense et pan-nucleaire de γH2AX induite par les UV pendant la phase de réplication restent à découvrir. Pour répondre à ces questions, nous avons mesuré la fraction de foci de γH2AX co-localisant avec 53BP1 après irradiation UV en immunofluorescence. Nous avons ensuite caracterisé l’effet de l’inhibition des kinases ATM, ATR, JNK et de la perte de la polymerase translesionelle Pol eta sur la forme diffuse, hyperintense et pan-nucleaire de γH2AX induite par les UV pendant la phase de réplication. Nous avons découvert que moins de 50% du nombre total des foci de γH2AX co-localisent avec 53BP1 après irradiation UV, comparés aux pourcentages proche de 100% observés après irradiation ionisante ou exposition au VP16. Par ailleurs, pendant la phase de réplication, l’induction par les rayons UV de la forme diffuse, hyperintense et pan-nucleaire de γH2AX n’est pas associée a la présence de foci de 53BP1. Nous montrons que la forme diffuse, hyperintense et pan-nucleaire de γH2AX induite par les UV pendant la phase de réplication est un signal pré-apoptotic médié par les kinases ATM et JNK, dont l’intensité est augmentée par l’inhibition de ATR et en l’absence de la polymerase translesionelle Pol eta. Nos résultats indiquent par conséquent que la réponse γH2AX après dommages à l’ADN induits par les UV est complexe et suggèrent qu’elle peut survenir en l’absence de cassure double brin. γH2AX ne devrait donc pas être utilisé systématiquement comme mesure directe du nombre de cassures double brin de l’ADN sans corroborations independantes supplémentaires.

Titre traduit

Characterization of the UV-induced gamma H2AX response during replication

Résumé

We compared UV irradiation and treatment with etoposide, an agent that causes DSBs during DNA replication. We found that during DNA replication UV irradiation induced at least three classes of γH2AX response: a minority of γH2AX foci co-localizing with 53BP1 foci that represent DSBs at replication sites; a majority of γH2AX foci that did not co-localize with 53BP1 foci; and cells with high levels of pan-nuclear γH2AX without foci of either γH2AX or 53BP1. ATM and JNK mediated the UV-induced pan-nuclear γH2AX, which preceded and paralleled UV-induced S phase apoptosis. These high levels of pan-nuclear γH2AX were further increased by loss of the bypass polymerase Pol eta or inhibition of ATR, but required the presence of the damage binding proteins of excision repair XPA and XPC. DSBs therefore represent a small variable fraction of UV-induced γH2AX foci dependent on repair capacity and are not detected within high levels of pan-nuclear γH2AX, a pre-apoptotic signal associated with ATM and JNK-dependent apoptosis during replication. The formation of γH2AX foci after treatment with DNA-damaging agents cannot therefore be used as a direct measure of DSBs without independent corroborating evidence.