Analyses biochimique et moléculaire du métabolisme des flavonoïdes dans la graine de colza (Brassica napus L. ) : vers l’élucidation des déterminants impliqués dans la pigmentation des téguments

par Bathide Auger

Thèse de doctorat en Biologie et agronomie

Sous la direction de Michel Renard.

Soutenue en 2010

à Rennes, Agrocampus Ouest .

mots clés

• Flavonoïdes -- Thèses et écrits académiques
• Brassica -- Thèses et écrits académiques

Résumé

Les procyanidines (PC) sont des flavonoïdes qui participent à la pigmentation brune de la graine de colza. Les PC s’accumulent spécifiquement dans les téguments et altèrent la qualité de la graine et du tourteau. Ainsi, chez les Brassica, le caractère « graines jaunes » (absence de PC) est corrélé à une augmentation de la teneur en huile dans la graine et une qualité supérieure du tourteau (teneur en protéines et digestibilité in vivo). Cependant, le développement de génotypes de colza à graines jaunes suppose une meilleure connaissance du métabolisme des flavonoïdes. L’objectif de cette thèse est donc l’identification et la caractérisation des déterminants biochimiques et moléculaires de la teneur en PC dans les graines de colza. Dans un premier temps, le profilage des flavonoïdes des téguments a été réalisé chez huit génotypes de colza à graines noires. Seize flavonoïdes ont été identifiés et quantifiés par LC-ESI-MS, parmi lesquels la (–)-épicatéchine, des PC et des flavonols. La teneur en PC est élevée dans le tégument interne de la graine, notamment dans l’endothélium et au niveau du pôle micropylechalaze. Parallèlement, une approche « gène candidat » a été entreprise pour cloner, chez les Brassica, les orthologues de sept gènes TRANSPARENT TESTA (TT) impliqués dans le métabolisme des flavonoïdes chez Arabidopsis thaliana. Nos résultats montrent que les gènes TT du colza (Bna. TT) forment des familles de 2 à 6 copies. Les différents paralogues sont exprimés dans la graine en développement selon un profil spatio-temporel cohérent avec l’accumulation des PC. Par ailleurs, les gènes Bna. TT sont capables de restaurer un phénotype sauvage chez les mutants tt d’Arabidopsis. Enfin, ils sont principalement positionnés dans des régions génomiques de B. Napus colinéaires avec celles d’Arabidopsis et certains co-localiseraient avec des QTL de pigmentation des graines. Dans une dernière partie, l’exploitation des résultats des analyses biochimiques et moléculaires a permis d’identifier, parmi des variants de colza à graines jaunes, les génotypes présentant une réduction spécifique de l’accumulation des PC. Dans le futur, la recherche de mutations dans les gènes Bna. TT pourra être entreprise par génétique inverse (TILLING) afin d’élargir la diversité allélique pour le caractère « réduction de la teneur en PC ». Enfin, il sera nécessaire d’étudier l’impact des mutations affectant la teneur en PC sur la qualité de la graine et sur la physiologie générale des plantes correspondantes.

Titre traduit

Biochemical and molecular analyses of flavonoid metabolism in oilseed rape (Brassica napus L. ) seed: towards the identification of key factors for seed coat pigmentation

Résumé

Procyanidins (PCs) are seed coat specific flavonoids that confer brown pigmentation to the B. Napus seed but impair the qualities from both seed and derived meal. Thus, the yellow-seeded trait (low-PC content) in Brassica is associated with increased seed oil content and with improved meal quality (protein content and meal digestibility). However, development of yellow-seeded lines requires better knowledge of the seed flavonoid pathway in B. Napus. Therefore, the present work aimed to identify and characterize the biochemical and molecular key determinants involved in the PC biosynthetic pathway in B. Napus seeds. In a first step, the profiling of seed coat flavonoids was monitored during seed development in eight black-seeded B. Napus genotypes. Sixteen different flavonoids including (–)-epicatechin, PCs and flavonols were identified and quantified by LC-ESI-MS. High amounts of PCs accumulated into the inner integument, especially within the endothelium and in the micropylechalaza region. In parallel, a “candidate gene” approach was undertaken to clone the Brassica orthologs from seven TRANSPARENT TESTA (TT) genes involved in seed flavonoid metabolism in A. Thaliana. Our results reported that oilseed rape TT genes (Bna. TT) belonged to small multigene families of 2 to 6 copies. The different paralogs were expressed in developing seeds following a spatio-temporal profile that was consistent with the PC accumulation pattern. In addition, phenotypic complementation was observed when Bna. TT genes were introduced into the corresponding Arabidopsis tt mutants. Finally, Bna. TT genes mapped to oilseed rape genomic regions that displayed collinearity with Arabidopsis counterparts and some of them displayed putative co-localisations with QTLs for seed pigmentation. In a last part, results from both metabolic and molecular analyses allowed identification of specific low-PC oilseed rape genotypes among lines with altered seed pigmentation. Future prospects will include the identification of mutations within Bna. TT genes through reverse genetic approach (TILLING) in order to establish a wider genetic diversity panel for low-PC trait. It will be also necessary to evaluate the impact of low-PC mutations on seed quality as well as on plant physiology.