Étude structurale et fonctionnelle de protéines impliquées dans la pathogénie bactérienne

par Pierre-Jean Matteï

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Andréa Dessen.

Soutenue en 2010

à Grenoble , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble) .

mots clés

• Cristallographie aux rayons X

Résumé

La première partie de cette thèse s'intéresse au complexe PBP2 :MreC impliqué dans l'élongation d' Helicobacter pylori, pathogène responsable de pathologies gastriques. Ce complexe a pu être mis en évidence in vitro dont nous avons déterminé la stoechiométrie par différentes méthodes. Ce complexe 1 : 1 a été analysé par diffusion des rayons X aux petits angles permettant de modéliser une enveloppe du complexe à basse résolution. Des cristaux du complexe ont été obtenus ainsi qu'un jeu de données à 2. 7 A. Par remplacement moléculaire, un domaine très conservé des PBP a pu être placé mais la présence de MreC est encore discutable. La seconde partie s'intéresse au système de sécrétion de type III, facteur de virulence majeur chez Pseudomonas a eruginosa , bactérie causant des maladies nosocomiales. PopB et PopD, deux protéines membranaires, forment un pore au niveau de la membrane d'une cellule-cible, nécessaire à la translocation de toxines. PopB a été purifiée sous forme soluble en présence de sa chaperonne, PcrH, complexe dissociable en présence de détergents et lipides. PopB seule, serait capable d'oligomériser en hexamère en formant des structures annulaires. La topologie du pore a également été déterminée dans des liposomes montrant ainsi que Po pB est insérée dans la membrane alors que PopD n'est associée que superficiellement. Pour finir, la structure de PcrH, a été résolue avec un peptide de PopD. Les résidus de Pc rH intervenant dans ce complexe sont essentiels à la sécrétion de PopD et à la formation du pore de translocation. Nous cherchons actuellement de petites molécules qui seraient capables d'interagir avec Pc rH et empêcheraient son interaction avec PopB et PopD.

Titre traduit

Structural and functional studies of proteins involved in bacterial pathogenesis

Résumé

The first part of this thesis focuses on the PBP2 :MreC complex which is implicated in the elogation steps of the cell wall of Helicobacter pylori, a pathogen involved in gastric adenocarcinoma. The existence of such a complex was demonstrated in vitro which we were able to determine its stoichiometry by different methods. This 1: 1 complex was also analyzed by Small Angle X-ray Scattering with which we could model an envelope at low resolution. Crystals were obtained which diffracted up to 2. 7 A. By molecular replacement we were able to place a highly conserved domain of PBP but the presence of MreC is not yet certain. The second part focuses on the type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa, major virulence factor of this bacterium. PopB and PopD, two membrane proteins, form a pore in the membrane of a host-cell, and are thus able to translocate toxins directly into the eukaryotic cytoplasm. We purified PopB in soluble form associated to its chaperone then dissociated it in the 'presence of detergents and lipids. PopB alone is then able to oligomerize into hexamers and form ring-like structures which are visible by electron microscopy. We then determined the topology of thE pore in liposomes. We have shown that PopB is embedded in the membrane whereas PopD is superficially associated to it. We have finally solved the structure of the chaperone of Po pB and PopD, PcrH, with a PopD synthetic peptide. The PcrH residues involved in this complex are essential for the secretion of PopD and thus formation of the translocation pore formation. We are currently searching for molecules that are able to interact with PcrH and thus prevent the interaction with PopB and PopD.