Développement d’outils cellulaires et moléculaires pour l’étude des interactions Candida - phagocytes ; Application à la caractérisation du gène OLE2 codant une désaturase chez C. lusitaniae

Development of cellular and molecular tools for the analysis of Candida - phagocytes interactions; Application to the functional analysis of a desaturase encoded by OLE2 in C. lusitaniae

• Auteur / Autrice : Sofiane El Kirat
• Direction : Thierry Noël
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences, technologie, santé. Microbiologie
• Date : Soutenance le 14/12/2010
• Etablissement(s) : Bordeaux 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-François Moreau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christophe D'Enfert, Thierry Jouault

Mots clés

Mots clés contrôlés

Macrophages

Neutrophiles

Candida

Candida lusitaniae

physiopathologie

Candidose

Mots clés libres

Candida

Macrophage

Neutrophile

Interaction hôte-pathogène

Fluorimétrie

Cytométrie en flux

Oxylipides

Délétion de gène

Banque de mutants

Candida

Macrophage

Neutrophil

Host-pathogen interaction

Fluorimetry

Flow cytometry

Oxylipids

Gene knock-out

Bank of mutants

Résumé

Les levures Candida sont des pathogènes opportunistes responsables d’infections graves chez les patients immunodéprimés. Au cours de ce travail, nous avons développé un modèle cellulaire in vitro pour la caractérisation multiparamétrique des phénotypes d’interaction entre les levures Candida et les macrophages et les neutrophiles, principaux effecteurs de la défense anti-Candida. Il repose sur l’utilisation de marqueurs fluorescents pour le suivi quantitatif de l’interaction en cytométrie en flux et en fluorimétrie. Ce modèle a été validé par la comparaison de l’interaction de trois espèces de levures, C. albicans, C. glabrata et C. lusitaniae, avec des macrophages murins et des neutrophiles humains. Deux stratégies principales de survie des levures à la phagocytose ont été mises en évidence : par la résistance à la phagolyse et la multiplication des levures à l’intérieur des phagocytes jusqu’à leur éclatement, ou par l’évitement de la phagocytose et la multiplication des levures à l’extérieur des phagocytes. L’interprétation des données quantitatives a été confirmée par microscopie à fluorescence et vidéo-microscopie. Afin de mieux comprendre les interactions Candida-phagocytes, nous avons mis au point des outils pour l’analyse fonctionnelle de gènes chez C. lusitaniae. Une stratégie de PCR chevauchante a été développée pour l’obtention de mutants nuls de C. lusitaniae, sans étape de clonage. C’est ainsi que le gène OLE2, codant une Δ9 désaturase d’acides gras potentiellement impliquée dans la biosynthèse de la prostaglandine PGE2, a été invalidé. Le mutant ole2Δ présentait de très nets défauts de filamentation et de reproduction sexuée. Par rapport à une souche sauvage, le mutant ole2∆ était massivement phagocyté par les macrophages, et la survie des phagocytes était plus importante, ce qui suggère un rôle important des lipides insaturés et des oxylipides dans la signalisation cellulaire au cours de l’interaction Candida-phagocytes. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons construit une banque de 10 000 mutants de C. lusitaniae par l’intégration aléatoire d’un marqueur dans le génome. Le criblage de cette banque à travers notre modèle cellulaire d’interaction permettra d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’interaction avec les phagocytes afin de mieux comprendre la physiopathologie des candidoses et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques.

Candida species are opportunistic pathogens causing severe infectious diseases in immunocompromised patients. In this work, we developed a tool for a multi-parameter characterization of the cell interactions between the yeasts Candida and both macrophages and neutrophils, which constitute the main defense against candidiasis. It relies on the labelling of each population with specific fluorescent markers, and on the use of fluorimetry and flow cytometry to assess interactions. The tool has been validated by comparing the interactions of three yeast species C. albicans, C. glabrata and C. lusitaniae, with murine macrophages and human neutrophils. We found that yeasts use two main ways for escaping phagocytosis, which has been confirmed using video-microscopy: either (1) by surviving to phagolysis and dividing into the phagosome until phagocytes burst, or (2) by avoiding phagocytosis and dividing outside phagocytes. In order to better understand the cellular and molecular mechanisms involved in Candida-phagocytes interactions, we developed new molecular tools for the functional analysis of genes in C. lusitaniae, notably a two-step cloning-free PCR-based method for the deletion of genes. This method was successfully used for the deletion of OLE2, a gene encoding a Δ9-desaturase of fatty acids, possibly implicated in prostaglandin PGE2 biosynthesis. The ole2Δ mutant exhibited strong defects in both pseudofilamention and sexual mating. During macrophages infection, ole2Δ yeast cells were massively internalized and triggered less phagocytes cell death than the wild type strain, suggesting that unsaturated fatty acids and/or oxylipids could play a role during interaction with phagocytes. Lastly, a bank of 10,000 mutants was constructed in C. lusitaniae by the random integration of a genetic marker in the genome. The screening of this bank through our tool to analyse cellular interactions will be undertaken to gain insights into understanding of the early stages of the infectious process.