Les protéines de jonction d'extrémités non homologues : nouvelles fonctions et connexions

par Sébastien Britton

Thèse de doctorat en Cancérologie

Sous la direction de Patrick Calsou et de Bernard Salles.

Soutenue en 2009

à Toulouse 3 .

mots clés

• Réparation de l'ADN
• DNA-PKcs
• Xrcc4
• Artemis
• Saf-a
• HnRNP U
• Apoptosis
• Phosphorylation
• Cancer
• Translocations
• Applications
• Protéines recombinées -- Thèses et écrits académiques
• Jonctions communicantes -- Thèses et écrits académiques
• ADN -- Réparation -- Thèses et écrits académiques
• Recombinaison génétique -- Thèses et écrits académiques
• Translocation (génétique) -- Thèses et écrits académiques

Résumé

Les Cassures Double-Brin de l'ADN (CDB) sont des lésions particulièrement toxiques dans les cellules humaines. Cette toxicité est exploitée pour tuer les cellules tumorales par radiothérapie. Chez l'homme, la voie majeure de réparation des CDB est la Jonction d'Extrémités Non-Homologues (NHEJ). Les protéines centrales de la NHEJ appartiennent à deux complexes : (i) le complexe DNA-PK qui assure la reconnaissance des CDB, composé de KU et de la sous-unité catalytique DNA-PKcs qui possède une activité sérine/thréonine kinase ; (ii) le complexe de ligature permettant la religature finale des deux extrémités de la CDB, composé de Cernunnos/XLF, XRCC4 et de l'ADN LIGASE IV. A ces protéines s'ajoutent des facteurs auxiliaires de maturation des extrémités, telle que ARTEMIS. Mes travaux de thèse répondent à deux objectifs : 1- caractériser de nouvelles fonctions pour les protéines de NHEJ et 2- établir une connexion de ces protéines avec de nouvelles protéines participant à la réponse cellulaire aux CDB. Ainsi, j'ai pu mettre en évidence que le facteur de transcription c-MYC était dégradé en réponse aux CDB. Cette dégradation est dépendante du protéasome et de l'activité de la DNA-PKcs. Elle pourrait contribuer, comme l'accumulation de p53 en réponse aux dommages, à l'arrêt de la croissance et de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, je me suis attaché à caractériser la fonction des phosphorylations de la protéine XRCC4 en réponse aux CDB. Dix sites de phosphorylation in cellulo et induits par les CDB ont été identifiés par spectrométrie de masse (SM). Des anticorps phosphospécifiques ont été établis et les sites mutés sur XRCC4. Ces outils ont permis d'identifier les kinases responsables et de mettre en évidence un état de phosphorylation de XRCC4 apparaissant dès de faibles quantités de CDB. Cet état persiste après réparation des CDB, ouvrant des perspectives d'applications. Pour remplacer facilement la protéine XRCC4 endogène par les mutants, un nouveau vecteur a été développé, le pCASE. . .

Titre traduit

New fonctions and connexions for non homologous end joining proteins

Résumé

DNA double-strand breaks (DSB) are highly toxic for human cells. This toxicity is used to eliminate cancer cells by radiotherapy or in some chemotherapies. The main DSB repair pathway in human cells is Non Homologous End Joining (NHEJ). Core NHEJ proteins belong to two complexes: 1- The DNA-PK complex, which recognizes DSB. It is composed of the KU heterodimer and of the catalytic subunit of DNA-PK (DNA-PKcs) which carries a serine/threonine kinase activity. 2- The ligature complex composed of XRCC4, DNA LIGASE IV and Cernunnos/XLF. Auxiliary proteins, like ARTEMIS, can work with the core proteins to help for the DNA processing. There were two main objectives for the work presented here: 1- characterize new functions for the already known NHEJ proteins and 2- establish connexions between the NHEJ proteins and new proteins potentially involved into the cell response to DSB. First, I show that the c-MYC transcription factor is degraded in response to DSB. I show this degradation is proteasome-dependant and DNA-PKcs-dependant. This degradation could contribute, as the p53-accumulation, to stop cell growth and cell proliferation in response to DSB. Furthermore, I try to characterize the potential functions of phosphorylation on one of the core proteins, XRCC4. Ten in cellulo phosphorylation sites were indentified by mass spectrometry (MS) in response to DSB. Phosphospecific antibodies were set up and the phospho-sites were mutated on XRCC4 cDNA. These tools allowed us to describe a new phosphorylated form of XRCC4 which is generated for low DSB amount. . .