L' interaction de la protéine fragile mental retardation et le complexe WAVE/SCAR chez la drosophile et son rôle dans la croissance synaptique et les voies de cytosquelette d'actine

Drosophila fragile X mental retardation protein and WAVE/SCAR complex interaction, its role in synapse growth and actin modifying pathways

• Auteur / Autrice : Hatice Bahar Sahin
• Direction : Angela Giangrande
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du développement
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Syndrome de l'X fragile

Plaque motrice

Actine

Drosophila melanogaster

Résumé

Le syndrome de l’X Fragile est la cause héréditaire la plus commune des retards mentaux qui touche environ 1 sur 4000 garçons et 1 sur 8000 femmes. Les patients ont en moyenne un IQ inférieur à 75, en raison de défauts de transmission et de plasticité neuronale. Ce syndrome est causé par la perte de fonction de la protéine « Fragile X Mental Retardation Protein » (FMRP) via des mécanismes mal connus. Comprendre le rôle de FMRP dans la plasticité neuronale est très important pour traiter cette maladies. Cependant, étant donnée la difficulté d’étudier la protéine chez les humains pour des raisons éthiques, la maladie a été explorée en plusieurs aspects sur des modèles animaux simples, tels que Drosophila melanogaster. Ceci permet d’utiliser des approches génétiques, de biologie cellulaire et moléculaire et électrophysiologiques. La jonction neuromusculaire de la drosophile (JNM) représente une structure très accessible et un modèle classique de plasticité neuronale. Les animaux mutants pour la protéine FMRP, connue comme régulatrice de la traduction, ont des JNM très ramifiées par rapport aux animaux sauvages. Ce phénotype ressemble beaucoup aux longues et immatures épines dendritiques des patients atteints du syndrome de l'X fragile. Ainsi, le phénotype basique de la carence en FMRP peut être modélisé avec la JNM de la drosophile. Plusieurs études soulignent le rôle du remodelage du cytosquelette d'actine dans le développement des axones et dans la formation des synapses. Le complexe WAVE est connu pour réguler le complexe actin nucleator Arp2/3 et favorise ainsi le remodelage du cytosquelette. Deux événements cruciaux sont donc nécessaires pour le développement et la modulation de la fonction de JNM: remodelage du cytosquelette d'actine et la synthèse des protéines locales. De plus, les données acquises au laboratoire suggèrent une interférence entre ces deux processus. L’orthologue de FMRP chez la drosophile (dFMR1) representerait donc un pont, en interagissant directement avec le complexe WAVE/SCAR, qui induit le remodelage du cytosquelette d'actine, et avec des ARNm, qui contrôle la traduction locale. A l'intérieur du complexe, la protéine WAVE interagit directement avec HSPC300. Dans ma première année de thèse, j'ai participé à la caractérisation de HSPC300, la plus petite sous-unité du complexe. Nous avons déterminé le rôle de HSPC300 in vivo, caractérisé HSPC300 chez la drosophile et définir son rôle dans la connectivité neuronale. HSPC300 est une protéine de 8 KD hautement enrichie dans le système nerveux, comme observé par un anticorps produit dans la maison. En générant des mutants HSPC300 perte et gain de fonction, nous avons observé que cette petite protéine est essentielle pour la stabilité du complexe WAVE et pour la morphogenèse de JNM. La perte de HSPC300 entraîne des graves défauts des axones et des JNM. Ces défauts sont sauvés en exprimant spécifiquement HSPC300 dans le tissu neural. Ces données impliquent HSPC300 comme un élément indispensable du complexe WAVE, et une protéine cruciale pour le développement du système nerveux (Qurashi et al. 2007). Nous avons précédemment montré que dFMR1 interagit biochimiquement avec CYFIP, un autre membre du complexe WAVE, et on a constaté que les deux protéines affectent la croissance JNM dans des sens opposés. DFMR1 supprime la croissance synaptique alors que CYFIP est nécessaire pour la croissance des synapses. La perte de dFMR1 induit une exagération de la ramification et de la croissance, tandis que la perte de CYFIP donne lieu à des synapses courtes mais extrêmement greffés. En outre, des expériences de dosage ont prouvé que dFMR1 et CYFIP agissent ensemble pour le contrôle de la croissance de JNM et travaillent de façon antagoniste. Durant ma deuxième année, j'ai réalisé un projet en collaboration avec les Pr. Zhang (Chine) et Hassan (VIB, Belgique) et visant à cartographier les régions d’interaction. Nous avons généré des mouches portant une mutation ponctuelle intragénique de dFMR1 obtenu par mutagenèse à l’EMS. Un crible par double hybride montre que des mutations intragéniques spécifiques empêchent FMRP d'interagir avec CYFIP. Nous avons ainsi montré que l’extrémité N-terminale de FMRP est essentielle pour l'interaction avec CYFIP. J'ai analysé le phénotype de JNM en utilisant dix mutants intragéniques dFMR1 et j’ai défini in vivo le domaine requis pour l’interaction FMRP-CYFIP. J'ai montré que les mutants dFMR1 qui maintiennent l'interaction biochimique avec CYFIP, maintiennent aussi l'interaction génétique; par conséquent, la surexpression de CYFIP sauve la surexpression de ces formes de dFMR1 mutantes. Chez les mouches porteuses d'une mutation qui abolit l’interaction biochimique dFMR1-CYFIP, la surexpression de CYFIP ne réprime plus le phénotype de gain de la fonction dFMR1. La co-surexpression crée un phénotype d’une croissance exagérée de JNM, qui n'est pas obtenu par un simple CYFIP ou dFMR1 surexpression. Toutes ces données prouvent in vivo que dFMR1 interagit avec CYFIP par l'intermédiaire de l’extrémité N-terminale de la protéine dFMR1. Leur interaction a un rôle important pour un contrôle précis de la croissance synaptique et pour le remodelage du cytosquelette d'actine. Cette étude est publiée dans le Journal of Neuroscience en Mars 2008 (Reeve et al. 2008). Durant ma troisième année de doctorat, j'ai étudié le rôle de CYFIP dans le remodelage du cytosquelette d'actine chez les photorécepteurs de la drosophile. En utilisant le système binaire UAS/Gal4 nous avons obtenu des mutants conditionnels CYFIP, temps et tissu spécifiques. Nous avons révélé le rôle de CYFIP dans des cellules précises: les cellules photoréceptrices et les cellules pigmentaires. Nous avons également révélé la conséquence directe du défaut de nucléation de l'actine qui est observée dans les jonctions cellule-cellule (Galy et al, in prep). Plusieurs groupes ont suggéré que FMRP a une activité comme répresseur traductionnel. Même si le mode de cette activité est encore un mystère, certains chercheurs ont fourni des preuves montrant que FMRP interagit avec plusieurs composants du complexe RISC. Au cours de ma quatrième année de thèse, j'ai étudié l'interaction FMRP avec RISC en collaboration avec le Pr Bozzetti, en Italie (Specchia et al, in prep). Dans tous les projets auxquels j'ai participé jusqu'à présent, je vise à faire la lumière sur les voies FMRP et WAVE. Nous avions l'intention de déchiffrer les voies contrôlant le remodelage du cytosquelette d'actine et la synthèse des protéines locales dans JNMs chez la mouche. Dans la présente thèse, tous les résultats sont discutés en détail.

Fragile X syndrome is the most common inherited cause of mental retardation affecting approximately 1 in 4000 males and 1 in 7000 females. Average IQ score of the patients is under 75 as a result of neural wiring and synaptic plasticity defects due to loss of functional Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP). FMRP is an RNA binding protein and a translational regulator highly abundant in the nervous system. We intend to explore underlying mechanisms of these defects using Drosophila (fruit fly) model organism. Several studies point out the role of actin cytoskeleton remodeling in synapse architecture and function. WAVE (/SCAR) complex stimulates the Arp2/3 complex actin nucleator and thereby promote cytoskeleton remodeling. Current data suggest that the crosstalk between actin cytoskeleton remodeling and local protein synthesis is essential for development and modulation of synapses. During my thesis, I have focused onto this topic and have the tackled three aspects of it: Characterization of the A) WAVE complex and its role in synaptic plasticity, B) the interaction between FMRP and WAVE complex, C) the actin cytoskeleton remodeling during morphogenesis. WAVE protein directly interacts with HSPC300, the smallest subunit of WAVE complex. Using targeted expression we characterize Drosophila HSPC300 and define its role in neural wiring. HSPC300 is highly enriched in the nervous system. Its mutation causes severe axonal/synaptic defects that are rescued by specific HSPC300 expression in the neural tissue. We conclude HSPC300 is an indispensable component of WAVE complex and an essential protein for nervous system development. We have previously shown that FMRP biochemically and genetically interacts with CYFIP, another member of the WAVE complex. To further characterize these interactions FMRP point mutations were generated in collaboration with two different labs. Particular mutants lose CYFIP binding. Using the intragenic mutants we point crucial FMRP residues for CYFIP interaction in vivo. FMRP is a negative regulator of neural growth. Here we describe nature of the FMRP-CYFIP genetic interaction in the context of neuromuscular synapses. We further assess CYFIP role on actin cytoskeleton in neatly organized fly eye and mostly actin-based photoreceptors. Making use of Drosophila genetics we define the spatiotemporal requirement of CYFIP for nervous system development. In all the projects I have been involved so far; I aimed at shedding light on FMRP and WAVE complex interaction. We intend to decipher these proteins and how their interactions regulate actin cytoskeleton remodeling, local protein synthesis and consequently neural connectivity using fly nervous system. I discuss these issues in the presented thesis.