Advances in mass spectrometry based proteomics : recherche de biomarqueurs et caractérisation de complexes covalents

Avancées en analyse protéomique par spectrométrie de masse : Biomarker discovery and covalent complexes characterization

• Auteur / Autrice : Guillaume Bechade
• Direction : Alain Van Dorsselaer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bioinformatique

Chromatographie en phase liquide

Spectrométrie de masse

Marqueurs biologiques

Protéomique

Liaisons covalentes

Protéines -- Analyse

Mots clés libres

Pont disulfure

Répétabilité

Résumé

L’engouement autour de l’analyse protéomique par spectrométrie de masse a masqué des questions essentielles comme la qualité et la validation des résultats. Des difficultés majeures persistent pour identifier toutes les protéines d’un échantillon et en obtenir un recouvrement de séquence maximal. Actuellement, l’information recueillie est largement incomplète et incertaine. Les progrès à réaliser passent par l’amélioration des techniques séparatives, de la spectrométrie de masse, et des outils bioinformatiques de validation des données protéomiques. Dans ce contexte, ce travail de thèse s’est articulé autour de deux thématiques : ‣ Le développement de méthodologies pour améliorer l’analyse protéomique. Une étude de la répétabilité des analyses nanoLC-MS/MS d’échantillons protéiques complexes a conduit à la mise en place de solutions simples pour améliorer le nombre et la qualité des identifications. Ces innovations ont été appliquées à (1) la recherche de biomarqueurs spécifiques de leucémies au diagnostic ambigu ; (2) l’identification de partenaires d’interaction de facteurs de transcription suppresseurs de tumeur dans le foie. ‣ La mise au point d’approches pour la caractérisation de complexes protéiques covalents à liaison cystéine-cystéine. Des mesures de protéines entières par LC-MS haute résolution et l’analyse par nanoLC-MS/MS de dipeptides ont notamment permis l’étude de mécanismes rédox intracellulaires. Ces travaux, proposant une utilisation plus fine et fiable de la spectrométrie de masse, ont montré de manière univoque la pertinence de l’approche protéomique pour la découverte clinique, l’analyse fonctionnelle et l’étude de mécanismes enzymatiques.

The hype surronding mass spectrometry based proteomics has hidden crucial points such as the quality and the validation of the results. Great difficulties remain to identify and get a maximal sequence coverage of all proteins contained in a sample. Collected information is currently clearly incomplete and uncertain. Progress is still needed in separation techniques, in mass spectrometry and in bioinformatics for the acquisition and the validation of proteomics data. In this context, this thesis hinges on two thematics : ‣ The development of methodologies to improve proteomic analysis. A study of the repeatability of nanoLC-MS/MS analyses of complex biological samples lead to the development of original solutions to improve the number and the quality of proteins identifications. These innovations have been applied to (1) the discovery of new biomakers for leukemia with ambiguous diagnosis ; (2) the identification of interaction partners for transcription factors implied in liver tumor suppression. ‣ The development of approches to characterize covalent complexes involving cystein-cystein linkage. Measurements of intact proteins by LC-MS with high mass resolution and analysis of bridged peptides by nanoLC-MS/MS were especially optimized to study intracellular redox mechanisms. This thesis highlights a cleverer and a more reliable application of mass spectrometry, and univocally shows the relevance of proteomic approaches for clinical discovery, functionnal analysis and enzymatic mechanisms study.