Biotechnological approaches for the manupulation of the genetic information in the mitochondria of plant and human cells

par Daria Mileshina-Nepomnyashchikh

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de André Dietrich et de Youri Konstantinov.

Soutenue en 2009

à Strasbourg .

mots clés

• Mitochondries -- Génétique
• Mitochondries végétales -- Génétique
• Transfection
• ADN recombiné
• Génie génétique

Titre traduit

Approches biotechnologiques pour la manipulation de l'information génétique dans les mitochondries des cellules végétales et humaines

Résumé

Les génomes mitochondriaux diffèrent dans leur structure, leur taille et leurs processus fonctionnels. Leur expression complexe est difficile à disséquer. Les maladies dues à des mutations dans l'ADN mitochondrial sont très répandues et la génétique des mitochondries a une grande importance agronomique. Il y a donc un fort besoin de manipuler le système génétique de ces organelles mais aucune approche n'a abouti à une méthodologie de transformation mitochondriale chez les mammifères et les plantes. Les principaux problèmes sont la transfection des organelles et le maintien de l'ADN transfecté. Les mitochondries isolées peuvent cependant importer de l'ADN. Sur la base de ce mécanisme, nous avons exploré des stratégies pour maintenir l'ADN exogène dans les organelles. Dans les mitochondries humaines, la recombinaison est rare. Nous avons ainsi tenté d'élaborer des constructions capables de se comporter comme des réplicons autonomes. Chez les plantes, la recombinaison homologue façonne le génome mitochondrial et nous avons réussi à intégrer une séquence-rapportrice dans l'ADN génomique des organelles. La compétence pour l'import d'ADN est susceptible d'être exploitable in vivo. Nous avons utilisé des vésicules mitochondriotropiques pour délivrer nos constructions à proximité des mitochondries dans des cellules humaines ou végétales. Suivant une autre stratégie, notre équipe a montré qu'un ARN passager associé à un mime d'ARNt et exprimé à partir d'un transgène nucléaire est importé dans les mitochondries des cellules végétales. Nous avons tenté d'analyser la fonctionnalité de l'ARN passager dans les mitochondries par des tests d'édition in vitro, in organello et in vivo.

Résumé

Mitochondrial genomes from various organisms differ in their structure, size and functional processes. Their complex expression is difficult to dissect. Diseases due to mutations in the mitochondrial DNA are widespread and mitochondrial genetics have a high agronomic relevance. There are thus strong needs to manipulate the mitochondrial genetic system in mammals and plants, but none of the attempted approaches has led to a mitochondrial transformation methodology in these organisms. The main problems to solve are the transfection of the organelles and the maintenance of the transfected DNA. Earlier experiments showed that isolated mitochondria can import DNA. Based on this mechanism, we have explored distinct strategies to achieve maintenance of exogenous DNA in human and plant organelles. In human mitochondria, recombination is a rare event. We have thus attempted to build and test constructs able to behave as autonomous replicons. In plants, homologous recombination is believed to shape the mitochondrial genome and we succeeded in integrating a reporter sequence into the organelle genomic DNA. The DNA import competence might be exploitable in vivo. We therefore used currently developed mitochondriotropic vesicles (DQAsomes, liposomes) to try and deliver our constructs to the vicinity of the mitochondria in human or plant cells. In a further, distinct strategy, our group showed that a passenger RNA associated with a tRNA mimic and expressed from a nuclear transgene is imported into the mitochondria of the transformed plant cells. We have tried to analyse the functionality of the passenger RNA in the mitochondria through in vitro, in organello and in vivo editing tests.