Impacts de la contrainte hydrique sur l'architecture du rosier miniature : étude des gènes impliqués et développement de protocoles de transformation génétique en vue de leur validation

par Virginie Portemer

Thèse de doctorat en Biologie des organismes, biotechnologies animales, végétales et microbiennes

Sous la direction de Rossitza Atanassova et de Rémi Lemoine.

Soutenue en 2009

à Poitiers .

mots clés

• Rosiers -- Effets de la sécheresse
• Expression génique
• Transformation génétique
• Embryogenèse somatique

Résumé

Afin de conserver la qualité architecturale du rosier miniature sans l'utilisation de régulateurs de croissance, l'application d'une contrainte hydrique a été substituée au paclobutrazole. La caractérisation de l'état de stress hydrique des rosiers a été réalisée par la mesure du potentiel hydrique et de la transpiration relative. Les effets morphologiques se traduisent par la réduction de la taille et l'augmentation du nombre de ramifications. Les études histologiques ont révèlé un accroissement significatif de l'aire du xylème. Ces impacts de la carence en eau sur la charpente des rosiers miniatures sont corrélés à l'accumulation du saccharose et du fructose dans la sève xylémienne. Le choix de gènes potentiellement impliqués dans la réponse du rosier au déficit hydrique a été effectué avec a priori en visant le transport et le métabolisme des sucres, des gènes du contrôle de la ramification et des marqueurs du stress hydrique. Des sondes spécifiques d'une vingtaine de gènes ont été clonées grâce à la base des EST de rosier existant ou par PCR avec des amorces dégénérées. Les gènes sélectionnés pour la modification de leur expression par macroarrays ont été confirmés par Northern blot et/ou RT-qPCR. Plusieurs gènes ont répondu face au stress hydrique imposé comme RhPGlcT1-2, RhSuSy et RhMAX1-2-3. La validation des gènes choisis requiert le développement de protocoles de transformation génétique du rosier. Deux protocoles de transformation via A. Tumefaciens ont été mis en place. Le premier utilise une suspension cellulaire non embryogène et vise une régénération directe. Le deuxième, basé sur l'embryogenèse somatique, a atteint une efficacité de transformation de 25%.

Titre traduit

Effects of water stress on miniature rose architecture, search for genes involved and development of genetic transformation protocols for their validation

Résumé

Effects of water stress on miniature rose architecture: search for genes involved and development of genetic transformation protocols for their validation To respect architectural quality required for miniature rose design without using growth regulators, the application of water stress was substituted to paclobutrazol. The characterization of water deficit level was done by the measurement of water potential and the relative daily transpiration. The morphologic effects correspond to the reduction of plant height and the increase of branching. The histological studies showed a noticeable increase of the xylem area. These water stress effects on miniature rose architecture were correlated with increase of sucrose and fructose in the xylem sap. Selection for genes involved in water stress response of miniature rose tree was performed with an a priori approach targed to genes involved in transport and metabolism of sugars, genes of branching control, and water deficit markers. Specific probes of twenty genes were cloned either on the basis of existing rose ESTs, or by PCR with degenerated primers completed by RACE-PCR. Genes selected for the modulation of their expression by means of macroarrays analysis were confirmed by Northern blot and/or RT-qPCR. Several genes were involved with water stress as RhPGlcT1-2, RhSuSy et RhMAX1-2-3. The functional validation of selected genes requires the development of protocols for genetic transformation of miniature roses. Two transformation protocols via A. Tumefaciens have been developed. The first protocol, using a non embryogenic suspension cell, aims direct plant regeneration. The second one, based on somatic embryogenesis, reaches a transformation efficiency of 25%.