Evaluation de l'efficacité d'un peptide pour la maîtrise des légionelles dans l'eau

par Nicolas Girardin

Thèse de doctorat en Recherche clinique, innovation technologique, santé publique

Sous la direction de Yann Héchard et de Jean-Marc Berjeaud.

Soutenue en 2009

à Poitiers .

mots clés

• Legionella pneumophila
• Bactériocines
• Protéines recombinées
• Désinfection
• Tours de refroidissement

Résumé

Les tours aéroréfrigérantes sont régulièrement mises en cause lors d'épidémies de légionellose et le respect des seuils réglementaires en L. Pneumophila, au sein de ces installations, nécessite l'utilisation de composés biocides. Un peptide sécrété par Staphylococcus warneri RK a été breveté en 2006 pour son activité anti-Legionella sous le nom de warnéricine RK. Dans le contexte actuel de diminution de l'impact des biocides sur l'environnement, l'objectif de cette étude a été de déterminer si la warnéricine RK, de par sa structure protéique et sa spécificité d'action, pouvait devenir un outil innovant pour la lutte raisonnée contre Legionella dans les circuits de tours aéroréfrigérantes. Dans la première partie de ce travail, l'étude de l'activité de la warnéricine RK contre des souches retrouvées dans les réseaux d'eau, a montré que son spectre d'activité est restreint au genre Legionella et à quelques souches de Bacillus. Ce peptide présente des résultats d'activité intéressants, dans des milieux de culture où il inhibe la croissance de L. Pneumophila à partir de 3,1 μg/mL et, dans l'eau déminéralisée où, à une concentration de 6,25 μg/mL, il réduit de 99 % la quantité de légionelles. La seconde partie de ce travail a consisté à développer des méthodes de production de grandes quantités de ce peptide afin de répondre aux besoins d’essais en simulateurs réseau ou en eaux de réseau. Deux approches de production ont été évaluées, à partir de la souche d'origine et à partir de souches d’E. Coli recombinantes. Les techniques développées ont permis la production de warnéricines recombinantes actives ainsi que la production d'un mélange de peptides actifs contre L. Pneumophila, provenant de la purification partielle du surnageant de S. Warneri RK. La dernière partie de ce travail a consisté à évaluer l'activité de la warnéricine RK contre les légionelles dans des conditions proches de celles retrouvées dans les tours aéroréfrigérantes. Suite à ces essais, il a été montré que certains sels pourraient être impliqués dans la précipitation de la warnéricine RK dans les eaux de réseau et dans les eaux de tours aéroréfrigérantes. Il semblerait également que, dans des conditions proches de celles retrouvées dans les circuits de tours aéroréfrigérantes, d'autres facteurs comme la présence d'autres microorganismes ou l'état physiologique des légionelles puissent limiter l’activité de la warnéricine RK.

Résumé

Cooling towers are regularly involved in outbreaks of legionnaires’ disease. Compliance with regulatory thresholds of L. Pneumophila, within these facilities requires the use of biocidal compounds. A peptide secreted by Staphylococcus, named warnericin RK, have been patented in 2006 for it anti-Legionella. In the present context of diminishing the impact of biocides on the environment, the objective of this study was to determine if, by its protein structure and its specificity of action, warnericin RK could become an innovative tool for reasoned fighting against Legionella in cooling towers circuits. In the first part of this work, it was showed that the spectrum of activity of the warnericin RK is restricted to the genus Legionella and some strains of Bacillus. This peptide presents interesting activity as it inhibits the growth of L. Pneumophila at 3. 1 mg/mL and it reduces 99% the amount of Legionella, in demineralised water, at a concentration of 6. 25 mg/mL. The second part of this work focus on the development of purification methods in order to produce large quantities of this peptide to meet test network simulators or water network. Two approaches to production have been evaluated: (i) from the original strain and (ii) from recombinant E. Coli. The techniques have enabled the production of recombinant active warnericin and the production of a mixture of peptides active against L. Pneumophila from the partial purification of the supernatant of S. Warneri RK. The last part of this work was to assess the activity of warnericin RK against Legionella in conditions close to those found in cooling towers. Following these tests, it was shown that salts may be involved in the precipitation of the warnericin in cooling tower water. It also appears that, in condition close to those found in systems of coling towers, other factors such as the presence of microorganisms or the physiological status Legionella can limit the activity of the warnericin RK.