Etude moléculaire des variations génétiques et épigénétiques de bovins clonés
par Béatrice de Montera
Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Génomique et biologie moléculaire
Sous la direction de Jean-Paul Renard.
Soutenue en 2009
à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .
mots clés-
Résumé
L’origine des variations ou anomalies chez les clones peut être génétique ou épigénétique. Nous avons voulu vérifier si le résultat final du clonage qui est de reproduire un génome était atteint en comparant 10 clones bovins (Holstein) issus du même individu donneur (5 adultes d’apparence physiologique normale (« normaux »), 5 morts en période périnatale (« pathologiques »)). L’analyse des caryotypes ne montre aucune différence détectable. Nous avons comparé les ADN génomiques 2 à 2 à l’aide d’une technique soustractive (RDA : Representational Difference Analysis) avec les enzymes Bam HI et Eco RI. Après crible PCR des séquences différentielles obtenues pour l’enzyme Bam HI, aucune ne s’avère correspondre à une différence de séquence entre clones. Le typage par microsatellites des 10 clones a permis d’identifier 2 microsatellites (sur 16 utilisés) mutés sur un allèle chez un clone « pathologique ». Pour vérifier si l’impact épigénétique dû au clonage, observé chez les embryons, s’estompe à l’âge adulte, nous avons fait l’étude de 38 bovins clonés adultes « normaux » de 2 races différentes (Holstein et Simmental, 9 génotypes) en mesurant la proportion globale de cytosines méthylées (5-méthylcytosine) dans le génome par une méthode de séparation chromatographique par électrophorèse capillaire (MECC). Nous observons une variabilité de la méthylation globale chez les clones qui est significativement plus importante que chez des jumelles et que les niveaux sont en moyenne plus élevés que chez les clones que chez des jumelles monozygotiques de même race. Nous en concluons que les clones bovins adultes et sains étudiés sont des variants d’un point de vue épigénétique.
-
Titre traduit
Molecular exploration of genetic and epigenetic variations in bovine clones
-
Résumé
Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) animals derived from the same donor genome are generally considered to be genetically identical. However, this issue remains poorly documented. Here, we have applied a modified protocol of RDA (Representational Difference Analysis) subtractive technique using Eco RI and Bam HI enzymes in order to reveal possible genetic differences between 10 SCNT Holstein cows of the same genotype (5 living adult cows and 5 perinatal aborted fetuses), all displaying normal caryotypes. No sequence polymorphism was detected after RDA Bam HI subtractions between these clones. No single nucleotide polymorphism was detected neither after hybridization on a 54K SNP bovine array. However, when using a panel of 16 microsatellites, 2 monoallelic length polymorphisms affecting 2 different markers (ETH 10, INRA 135) were evidenced in one aborted fetus. The epigenetic status of such healthy adult clones has never been investigated. Here we show that global DNA methylation levels of 38 healthy adult bovine clones are highly variable between individuals of the same genotype in comparison with monozygotic twins. We used a capillary electrophoresis technique to measure 5methyl-cytosine (5mC) content in white blood cells DNA from 38 healthy female clones (Holstein genotypes, n=4, Simmental genotypes n=5). The comparison with twins confirmed a SCNT cloning effect illustrated by a clone-specific variability of DNA methylation and provided new evidence of DNA hypermethylation by SCNT. These data clearly demonstrate that apparently healthy SCNT clones must be considered as epigenome variants.
