Flavonoid oxidation in Arabidopsis thaliana seeds : Functional analysis of the TRANSPARENT TESTA 10 gene encoding a polyphenoloxidase of the laccase type

• Auteur / Autrice : Przemyslaw Bidzinski
• Direction : Isabelle Debeaujon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques. Sciences de la vie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Laccase

Flavonoïdes

Arabidopsis thaliana

Résumé

L’objectif de cette thèse était de réaliser une analyse fonctionnelle du gène TRANSPARENT TESTA 10 (TT10) codant une laccase (AtLAC15) impliquée dans l’oxydation des flavonoïdes de la graine d’Arabidopsis. Une partie de l’étude était consacrée à l’analyse des mécanismes de régulation contrôlant le pattern développemental d’expression du gène TT10 dans les graines et les parties végétatives. Une dissection fonctionnelle en 5’ d’un promoteur de 2,0 kb réalisée à l'aide du gène rapporteur uidA codant la b-glucuronidase (GUS) a été réalisée pour identifier les régions responsables de l’activation du promoteur dans les graines et les autres parties de la plante. Le promoteur de TT10 est activé exclusivement dans les téguments de la graine et les siliques. Une mutagénèse dirigée a été réalisée dans une région de 194 pb nécessaire à l’expression dans les téguments, pour préciser la fonctionnalité des éléments régulateurs agissant en cis identifiés in silico. L’expression du gène TT10 mesurée par qRT-PCR dans différents tissus et à différents stades de développement est en accord avec le pattern d’activité du promoteur. Une variation naturelle pour l’expression de TT10 a aussi été détectée parmi plusieurs accessions d’Arabidopsis, avec des niveaux d’ARNm mesurés chez Cvi, Ler et Sha fortement réduits par rapport à ceux relevés chez Ws, Col et Bay. L’impact de ce polymorphisme moléculaire sur la composition en flavonoïdes de la graine, analysée sur graines matures par LC-MS, est discuté. TT10 est le seul membre de la famille des laccases à être exprimé fortement dans les graines.

The purpose of this thesis was to perform a functional characterization of the TRANSPARENT TESTA 10 (TT10) gene encoding a laccase (AtLAC15) involved in flavonoid oxidation in Arabidopsis seed. A part of the work was devoted to the analysis of the regulatory mechanisms controlling the developmental pattern of TT10 gene expression in seeds and vegetative plant parts. The functional 5’-dissection of a 2. 0-kb promoter realized with the uidA reporter gene encoding b-glucuronidase (GUS) was performed to identify regions responsibles for activation in seed and other plant organs. TT10 promoter happens to be activated exclusively in seed coat and siliques. Directed mutagenesis was undertaken to precise the regulatory role of in silico-detected cis-acting regulatory elements located in a 194-bp region necessary for expression in seed coat. TT10 gene expression assessed in different tissues at various stages of development using qRT-PCR matched promoter activity pattern. Natural variation for TT10 expression among Arabidopsis accessions was also detected, with the levels of TT10 mRNA in Cvi, Ler and Sha being strongly reduced compared to the ones in Ws, Col and Bay. The impact of this molecular polymorphism on seed flavonoid composition, as analyzed on mature seeds with LC-MS, is discussed. TT10 appeared to be the only member of the laccase gene family to be strongly expressed in seeds.