New strategies in proteomics

• Auteur / Autrice : Giovanni Chiappetta
• Direction : Jean Rossier, Marino Gennaro
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Paris 6 en cotutelle avec Università degli studi di Napoli Federico II
• Jury : Président / Présidente : Germain Trugnan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Joëlle Vinh, Pasquale De Santis, Vincenzo Scarlato, Claudio Palleschi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ariane Jalila Simaan, Giovanni Sannia

Mots clés

Mots clés libres

Protéomique

Spectrométrie de masse

Nitration des protéines

Modifications post tradutionelles

Résumé

Le travail de thèse présenté dans ce mémoire consiste en la mise au point de nouvelles méthodologies d’analyse pour les études protéomiques. Le sujet principal de ce travail de thèse a été l’optimisation de procédures innovantes qui se basent sur la manipulation chimique de mélanges peptidiques et sur l’ analyses avancée par spectrométrie de masse MS3, et qui ont pour objectif d’améliorer les capacités d’identification et quantification des modifications post-traductionelles par une approche protéomique. Une nouvelle procédure d’identification des sites de nitration des protéines a été mise au point, par le moyen d’une modification sélective des peptides nitrés après dansylation et par l’analyse par spectrométrie de masse en modalité Precursor Ion Scan/MS3. Une telle stratégie pemet de surmonter quelques unes des limites classiques de l’analyse des sites de nitration des protéines, comme la nécessité d’utiliser des techniques d’enrichissement chromatographique mais permet aussi de surmonter les difficultés d’identification des peptides nitrés par spectrométrie de masse. Il a également été optimisé une procédure pour l’identification et la quantification des sites de nitration des protéines par le biais d’une modification sélective des peptides nitrés avec le réactif iTRAQ et par une analyse successive par spectrométrie de masse en modalité Precursor Ion Scan. Cette technique peut etre considérée comme étant la première stratégie capable simultanément d’identifier et de quantifier les sites de nitration des protéines par spectrométrie de masse. En outre, différentes conditions d’analyses pour l’identification des phospopeptides dans des mélanges biologiques ont été évaluées par analyse LC-MSMS en modalité neutral loss et precursor ion scan. De plus, une nouvelle procédure qui utilise la chimie des micro-ondes afin d’améliorer les analyses LC-MALDI-MSMS a également été optimisée, par un marquage extensif des mélanges peptidiques analysés avec du chlorure de dansyle. Cette étude a également permis de comprendre les caractéristiques de la fragmentation des peptides dansylés dans des éxpériences de post source decay. Enfin, des expériences préliminaires ont été réalisées afin de vérifier la possibilité d’utiliser les dérivés de la dansylation pour développer une nouvelle procédure finalisée à l’identification des états d’oxydations des résidus de cystéine des protéines séparées par une électrophorèse bi-dimensionelle. Les rèsultats obtenus indiquent que les dérivés du dansyle permettent de déterminer les variations des états d’oxydation des cysteines par des technniques de cytométrie en flux, électrophorèse bidimensionelle et spectrométrie de masse