Etude des mécanismes de reconnaissance et de transfert de l’ubiquitine et de NEDD8

• Auteur / Autrice : Judith Souphron
• Direction : Brenda Schulman, Arnaud Ducruix
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacie
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale du Médicament (....-2009 ; Paris)
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université Paris Descartes. Faculté de pharmacie de Paris (....-2019)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ubiquitination

Ubiquitine

Mots clés libres

Nedd8

Résumé

Les modifications post-traductionnelles par l'ubiquitine (Ub) et les protéines dites ubiquitine-like (Ubls) sont des mécanismes de régulation des protéines majeurs chez les eucaryotes. Ub et les Ubls sont conjuguées à d’autres protéines, dans le but d'altérer la fonction de ces dernières. Les Ubls sont étiquetées à leurs protéines cibles par des cascades enzymatiques très proches impliquant de manière séquentielle trois enzymes E1, E2, et E3. Cette étude concerne les mécanismes de reconnaissance de l'ubiquitine et de NEDD8 par les enzymes impliquées dans leur cascade au cours des réactions enzymatiques de transfert. Premièrement, nous avons étudié les mécanismes moléculaires permettant à l’E1, NAE1-UBA3 de distinguer entre l'ubiquitine et NEDD8 au cours de la première étape de la réaction enzymatique. Nous avons étudié en détails les rôles de deux résidus impliqués dans le mécanisme permettant la spécificité de la liaison E1-Ubl: le résidu 72 de NEDD8 et le résidu 190 de la sous-unité UBA3 de l’E1 hétérodimérique NAE1-UBA3. Nous avons montré que l’Arg190 de NAE1-UBA3 agissait comme une barrière empêchant la liaison de l’Arg72 venant de l’ubiquitine. Par ailleurs, la préférence de NAE1-UBA3 pour l’Ala72 de NEDD8 est induite par un mécanisme indirect, dans lequel l’Ala72 permet à l’Arg190 de NAE1-UBA3 d’être correctement positionnée. Nos résultats montrent que les résidus situés à des positions identiques dans des protéines impliquées dans des voies de conjugaison distinctes utilisent des mécanismes différents, dans le but de permettre la sélectivité d’une interaction. De plus, cette étude démontre que la spécificité d’une interaction peut être amplifiée par des barrières qui empêchent la liaison des protéines appartenant à des cascades distinctes. Deuxièmement, nous nous sommes axés sur la reconnaissance de l’ubiquitine au cours des réactions enzymatiques impliquant la seconde plus grande famille de ligases pour l’ubiquitination: les E3s à domaine HECT (homologous to E6AP C-terminus). Pour les cascades impliquant les E3s à domaine HECT, l’ubiquitine est transférée de la cystéine catalytique d’une E2 à la cystéine catalytique localisée dans le lobe en C-terminale des E3s. Dans cette deuxième étude, nous présentons des analyses biochimiques et structurales du processus de transfert de l'ubiquitine d'une E2 à une E3 à HECT domaine. Nous avons déterminé la structure cristalline d'un complexe entre le domaine HECT de NEDD4L et l’E2, UbcH5B liée de manière covalente à l’ubiquitine via son site actif (UbcH5B~Ub). Des études in vitro et in vivo du complexe ont révélé l'importance des interactions non covalentes entre UbcH5B et le N-lobe du domaine HECT, et entre l’ubiquitine et le C-lobe du domaine HECT pour le transfert de l'ubiquitine. Cette étude a permis de montrer, pour la première fois, comment les domaines de l’ubiquitine, des enzymes E2 et E3 à domaine HECT sont engagés pour permettre la réaction de transfert. En conclusion, ces deux études permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à la reconnaissance et à la conjugaison des Ubls impliquées dans les voies de l'ubiquitination et de la NEDD8ylation.

Post-translational covalent modification by ubiquitin (Ub) and ubiquitin-like proteins (Ubls) is a major eukaryotic mechanism for regulating protein function. Ub and Ubls are conjugated to macromolecules in order to alter the function of their target proteins in distinct ways. Ubls are directed to their targets by related but separate cascades of enzymes in classes known as E1, E2 and E3. Here, I report how ubiquitin and NEDD8 are being recognized by their cognate enzymes within two distinct steps of their enzymatic cascade, which is important for ubiquitin and NEDD8 downstream functions. First, I studied the molecular “code” by which ubiquitin and NEDD8 are distinguished by their enzymatic machineries during the first step of the cascade. I describe biophysical, biochemical, and X-ray crystallographic dissection of the specificity functions of a key NEDD8 residue (72) and a correspondingly important residue (190) from the UBA3 subunit of NEDD8’s heterodimeric E1 (the NAE1-UBA3 complex). I found that NAE1-UBA3’s preference for NEDD8’s Ala72 to be indirect, due to proper positioning of UBA3’s Arg190. However, NAE1-UBA3’s failure to interact with a Ubl having Arg72 is not due to a lack of a favorable interaction, but rather arises from UBA3’s Arg190 acting as a negative gate. This study demonstrates that parallel residues from different Ubl pathways can utilize distinct mechanisms to dictate interaction selectivity, and specificity can be amplified by barriers that prevent binding to components of different conjugation cascades. Second, I focused on ubiquitin recognition during downstream step in E1-E2-E3 cascades, involving the second largest class of ubiquitin E3, the HECT (Homologous to E6AP C-terminus) family. For cascades involving E3s in the HECT class, Ub is transferred from an associated E2 to the acceptor Cys in the HECT domain C-lobe. This second study involved biochemical and structural analyses of the transfer reaction process of ubiquitin from an E2 to a HECT E3 catalytic cysteine. I determined the crystal structure of a complex between the HECT domain of NEDD4L and the E2 UbcH5B bearing a covalently-linked Ub at its active site (UbcH5B~Ub). In vitro and In vivo analysis of the complex revealed the importance of non-covalent interactions between UbcH5B and the HECT N-lobe and between Ub and the HECT domain C-lobe for ubiquitin transfer. This study provides insights, for the first time, into how distinct domains on Ub, E2 and HECT E3 are engaged to allow ubiquitin transfer to an HECT E3. Taken together, both studies provide a deeper understanding into the molecular mechanisms of Ubl recognition and conjugation underlying the ubiquitin and NEDD8 pathways.