Rôle de la protéine adaptatrice 3BP2/SH3BP2 dans la régulation de l'homéostasie osseuse

par Amel Guezguez

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Marcel Deckert.

Soutenue en 2011

à Nice .

mots clés

• Protéine Trance -- Thèses et écrits académiques
• Src kinase -- Thèses et écrits académiques
• Ostéopétrose -- Thèses et écrits académiques
• Facteurs de transcription -- Thèses et écrits académiques
• Dysplasie osseuse -- Thèses et écrits académiques

Résumé

Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées capables de résorber le tissu osseux, elles se différencient à partir de la lignée hématopoïétique en présence de Receptor Activator of Nuclear Factor NF-kB (RANK-L) et M-CSF (Macrophage-Colony Stimulating Factor). Les récepteurs RANK et M-CSFR relaient et amplifient le signal de leurs ligands en activant de multiples voies de signalisation intracellulaire dont l’intégration aboutira à l’intégration de NFATc1, facteur de transcription essentiel pour la différenciation des ostéoclastes. Les protéines adaptatrices, du fait de leur structure, jouent un rôle crucial dans cette signalisation. De nombreuses études ont montré que la protéine adaptatrice 3BP2/ SH3BP2, initialement identifiée comme une protéine interagissant avec la kinase c-Abl puis comme partenaire des kinases de la famille Src et Syk, joue un rôle important dans la signalisation et l’activation des leucocytes. Des études génétiques ont montré que des mutations du gène 3bp2 chez l’homme sont associées à une dysplasie osseuse génétique « Chérubinisme » et à un phénotype ostéopénique inflammatoire chez la souris. Ces observations laissent entrevoir un rôle additionnel de 3BP2 dans la régulation des cellules du système osseux et particulièrement la différenciation des ostéoclastes. Dans le but d’étudier le rôle de 3BP2 dans la différenciation des ostéoclastes, nous avons utilisé la lignée RAW264. 7, une lignée myélo-monocytaire murine capable de se différencier en ostéoclaste en présence de RANK-L. Avec la méthode d’interférence ARN, nous avons développé des modèles cellulaires « perte de fonction » n’exprimant plus 3BP2. Ces modèles nous ont permis de montrer que l’expression de 3BP2 est essentielle pour la différenciation des ostéoclastes et que son absence altère la différenciation de ces cellules en ostéoclastes. Nous avons ainsi montré que l’effet de l’absence de 3BP2 est restreint à la voie de signalisation RANK sans aucune conséquence sur la voie de signalisation GM-CSF et la différenciation des cellules dendritiques. Dans un premier temps, nous avons montré que cet effet « perte de fonction » est lié à un défaut de polymérisation d’actine et d’activation de la protéine tyrosine kinase Src et des voies de signalisation MAPKs (MEK, ERK, JNK) contrôlées par RANK-L. Nous avons observé également une inhibition de l’induction de NFATc1 et AP-1, des facteurs de transcription essentiels à la différenciation des ostéoclastes. Par la suite, l’analyse transcriptionnelle de différentes protéines impliquées dans la différenciation des ostéoclastes (CaR, TRAP, Cathépsine K) a révélée une inhibition significative de leur induction dans les cellules déficients en 3BP2. Nous avons finalement montré que la reconstruction avec des molécules Src et NFATc1 constitutivement actives restaure la différenciation des ostéoclastes dans les cellules déficients en 3BP2. En conclusion, notre étude a montré que la protéine 3BP2, via la protéine tyrosine kinase Src, joue un rôle central au cours de la différenciation des ostéoclastes en contrôlant les voies de signalisation RANK, impliquées dans l’activation de NFATc1, facteur de transcription clé de la différenciation ostéoclastique.

Titre traduit

Role of 3BP2/SH3BP2 adaptator protein in regulation of bone homeostasis

Résumé

Osteoclasts are multinucleated bone-resorbing cells, which derived from hematopoietic cells of the monocyte/macrophage lineage following stimulation with two essential cytokines, RANK-L and M-CSF. The molecular pathways involved in osteoclast formation involve complex network of signaling molecules, including adaptor proteins kinases, which ultimately lead to the activation of a transcriptional program in which NFATc1 plays a pivotal role. The adaptor protein 3BP2, originally identified as a c-Abl binding protein, and a partner of Src and Syk kinases families, has been involved in leucocytes signaling and activation? Genetic studies have further associated mutations of the 3BP2 gene of the human bone disease Cherubism and to inflammation and bone dysfunction in mouse. However, how wild-type 3BP2 exactly functions in osteoclast differentiation has yet been elucidated. In this study, we have investigated the role of endogenous 3BP2 exactly functions in osteoclast differentiation using siRNA-mediated silencing of 3BP2 expression in the RAW264. 7 monocyte/macrophage cell line. We show here that 3BP2 was required for RANK-L-induced differentiation of RAW264. 7 cells was associated with reduced RANK-L-induced actin reorganization and Src, ERK, JNK, IKKα/β, but not p38 phosphorylation. Following RANK-L stimulation, the 3BP2-deficient cells exhibited impaired up-regulation of Src, c-fos and NFATC1 mRNA expression, whereas NFATc2 and NFATc3messengers were not significantly affected. Compared to control cells, 3BP2-knockdown cells induced to osteoclast by RANK-L displayed no up-regulation of Src and NFATc1 proteins? In addition, the introduction of constitutively active mutants of Src and NAFTc1 in 3NP2 deficient cells restored osteoclast differentiation. Finally, we provide evidence that enhanced osteoclast differentiation triggered by a 3BP2 Cherubism mutant also required NFAT activity in RAW264. 7 cells. Together, this study demonstrates that 3BP2 is a key regulator of RANK-mediated osteoclastogenesis through Src and NFATc1 activation.