Construction et optimisation d’anticorps intracellulaires pour l’analyse in vivo des protéines

par Pascal Philibert

Thèse de doctorat en Biologie santé. Sciences chimiques et biologiques pour la santé

Sous la direction de Pierre Martineau.

Soutenue en 2009

à Montpellier 1 , en partenariat avec Université de Montpellier I. UFR des sciences pharmaceutiques et biologiques (1968-2014) (autre partenaire) .

mots clés

• Anticorps -- Thèses et écrits académiques
• Anticorps recombinés -- Thèses et écrits académiques
• Immunothérapie -- Thèses et écrits académiques
• Anticorps -- Biotechnologie -- Thèses et écrits académiques
• Protéines recombinées -- Thèses et écrits académiques

Résumé

L’immunisation intracellulaire utilise des fragments d’anticorps (intracorps) exprimés à l’intérieur de la cellule afin de se lier à une protéine et d’inhiber sa fonction. Le problème majeur limitant l’utilisation des intracorps est l’absence de formation des ponts disulfures en milieu cytoplasmique (réducteur). En utilisant un fragment d’anticorps, le scFv 13R4, sélectionné pour sa forte expression et sa très bonne solubilité dans le cytoplasme malgré l’absence des ponts disulfures, nous avons construit par greffage des boucles hypervariables (CDR) un anticorps dirigé contre l'oncoprotéine E6 du papillomavirus. L'anticorps obtenu après optimisation présente des caractéristiques d'expression et de solubilité proche de l'anticorps 13R4 originel en ayant acquis les propriétés de reconnaissance de l'anticorps anti-protéine E6. Toutefois, devant les difficultés rencontrées pour obtenir des intracorps par greffages des boucles hypervariables, nous avons créé une banque d'anticorps optimisés pour l'immunisation intracellulaire. Pour cela, différentes boucles hypervariables ont été greffées sur la charpente de l'anticorps 13R4 en respectant la diversité des CDR observée dans les anticorps naturels humains. Cette banque a été testée contre différentes cibles intracellulaires et confirme son utilité pour isoler rapidement des intracorps.

Titre traduit

Construction and optimization of intracellular antibodies for in vivo analysis of proteins

Résumé

Intracellular immunization consists in the expression of antibody fragments inside the cell that bind to a protein and interfer with its function. The main problem limiting the use of intrabodies is the absence of disulfide bonds in the reducing conditions pertaining in the cell cytoplasm. We used the scFv13R4 antibody fragment, selected for its high soluble expression level in the cytoplasm, to construct, by loop (CDR) grafting, an antibody fragment against the E6 protein of human papillomavirus type 16. After several optimization steps, cytoplasmic soluble expression of the grafted anti-E6-protein antibody fragment was comparable to that of the original antibody (13R4). To circumvent this long procedure, we designed and constructed an optimised library of antibody fragments for intracellular immunization, based on the scFv13R4 framework with randomized CDR3 loops mimicking the natural diversity of human CDR loop sequences. This library has been tested against several proteins, demonstrating that it is now possible to rapidly obtain intrabodies against any protein.