Choline et éthanolamine kinases chez Plasmodium falciparum : Caractérisation biochimique et cellulaire des enzymes et de leur activité

par Blandine Alberge

Thèse de doctorat en Sciences chimiques et biologiques pour la santé. Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Henri Vial.

Soutenue en 2009

à Montpellier 1 , en partenariat avec Université de Montpellier I. UFR des sciences pharmaceutiques et biologiques (1968-2014) (autre partenaire) .

mots clés

• Plasmodium falciparum
• Paludisme
• Antipaludiques
• Choline kinase
• Phospholipides -- Biosynthèse
• Inhibiteurs
• Paludisme -- Thérapeutique
• Paludisme -- Prévention
• Pharmacocinétique

Résumé

Le développement de Plasmodium falciparum, agent du paludisme, est indissociable d’une production considérable de membranes par le parasite. Les biosynthèses de phosphatidylcholine (PC) et de phosphatidyléthanolamine (PE), principaux constituants de ces membranes, sont essentielles à la croissance du parasite au cours de son développement intraérythrocytaire, phase durant laquelle sont observés les symptômes cliniques de la maladie. Les travaux de cette thèse ont eu pour objectifs la caractérisation des premières enzymes des voies de synthèse de novo de PC et de PE chez P. Falciparum, soit respectivement la choline kinase (PfCK) et l’éthanolamine kinase (PfEK). Les paramètres cinétiques ont été déterminés sur les kinases recombinantes exprimées en système bactérien puis purifiées, ainsi que sur les protéines endogènes provenant d’extraits parasitaires. La PfCK et la PfEK paraissent spécifiques de leur substrat respectif, à savoir la choline ou l’éthanolamine. Nous avons étudié l’inhibition des kinases recombinantes et endogènes, par des composés analogues de substrat et par une nouvelle molécule antipaludique T3/SAR97276A, actuellement en essais cliniques de phase II. Chacune de ces enzymes est inhibée spécifiquement par l’analogue de substrat. D’autre part, T3, bien que conçu comme un analogue de choline, apparait être un inhibiteur compétitif de la PfCK mais également de la PfEK. Nous avons immunisé des souris avec les protéines recombinantes purifiées. Au moyen des séra polyclonaux murins reconnaissant spécifiquement la PfCK ou la PfEK, nous avons montré que ces kinases sont localisées dans le cytoplasme de P. Falciparum et sont exprimées à tous les stades du cycle érythrocytaire de ce parasite, particulièrement au stade mature. Nous avons caractérisé des souches de P. Falciparum transgéniques surexprimant la PfCK ou la PfEK. La sensibilité de ces souches a été mesurée vis-à-vis des analogues de substrat, de T3 et de composés antipaludiques afin d’élucider l’impact, in situ, de ces composés sur la croissance des parasites.

Titre traduit

Cellular and biochemical characterization of Plasmodium falciparum choline and ethanolamine kinases

Résumé

The growth of Plasmodium falciparum, a vector of malaria, within human erythrocytes, is linked to a huge production of membranes. Biosynthesis of phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE), the main phospholipids of malarial membranes, is crucial for the parasite survival. In this thesis, we expose the characterization of the first enzymes of the de novo biosynthesis pathways of PC and PE in P. Falciparum, choline kinase (PfCK) and ethanolamine kinase (PfEK) respectively. Kinetic parameters of both enzymes have been determined, in vitro, on purified recombinant proteins and endogenous ones. PfCK and PfEK are specific for their respective substrates, choline or ethanolamine. We studied the inhibition of both recombinant and endogenous kinases by specific substrate analogs and by a new anti-malarial compound T3/SAR97276A, which is currently in clinical trials. These enzymes were specifically inhibited by the respective substrate analog. In contrast, T3 designed as a choline analog, affected similarly PfCK and PfEK activities. We immunized mice with recombinant pure proteins. With the specific polyclonal murine sera, we localized PfCK and PfEK in the parasitic cytoplasm. These kinases are increasely expressed during the intra-erythrocytic life cycle of P. Falciparum. We also characterized malarial transgenic strains over-expressing PfCK or PfEK, to determine the effect of inhibitory compounds on the intra-erythrocytic growth of P. Falciparum.