Functional localization study of acid trehalase (Ath1) and its secretion mechanism in the yeast Saccharomyces cerevisiae

par Susu He

Thèse de doctorat en Ingénieries microbienne et enzymatique

Sous la direction de Jean-Marie François et de Jean-Luc Parrou.

Soutenue en 2009

à Toulouse, INSA .

mots clés

• Localisation fonctionnelle
• Saccharomyces cerevisiae -- Métabolisme -- Thèses et écrits académiques
• Microscopie de fluorescence -- Thèses et écrits académiques
• Tréhalose -- Métabolisme -- Sécrétion -- Thèses et écrits académiques

Titre traduit

Étude de la localisation fonctionnelle et du mécanisme de sécrétion de la tréhalase acide (Ath1) chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Résumé

Des études précédentes sur la levure Saccharomyces cerevisiae ont proposé une vacuolaire localisation pour Ath1, qui est difficile à concilier avec sa capacité à hydrolyser tréhalose exogènes. Dans notre étude, nous avons utilisé la microscopie fluorescente à montrer que Ath1 est bien localisées dans la vacuole, mais aussi à la surface cellulaire. Néanmoins, que Ath1 à la surface cellulaire est responsable pour la croissance sur tréhalose, et Ath1 dans la vacuole est enclin à protéolyse. Deuxième partie sur l’étude de domaine protéique, nous avons montré que les N-terminales 131 acides aminés de Ath1 sont le domaine potentiel pour l’adressage à la surface, parmi le domaine transmembranaire est indispensable. Enfin, la voie de ciblage de Ath1 dans la cellule de levure a été étudié. En utilisant différent mutants impliqués dans la voie de ciblage à la vacuole, nous avons prouvé que le ciblage d'Ath1 vers la vacuole emprunte une voie intracellulaire, indépendant de l’endocytosis. De plus, le ciblage à la surface probablement emprunte la voie "classique" de sécrétion en aide d’un group de Sec protéines. Ces études sont en cours

Résumé

Trehalose (alpha-D-glucopyranosyl (1→1) alpha-D-gluocopyranoside) is a non-reducing disaccharide found in many organisms including yeasts, fungi, bacteria, plants and insects. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, trehalose is one of the major storage carbohydrates, accounting for more than 25% of cell dry mass depending on growth conditions and stage of the yeast life cycle (Hottiger et al. , 1987a; Jules et al. , 2008; Lillie and Pringle, 1980). The accumulation of intracellular trehalose has two potential functions. First, it constitutes an endogenous storage of carbon and energy during spore germination and in resting cells. Second, trehalose acts as a stabilizer of cellular membranes and proteins (Francois and Parrou, 2001; Simola et al. , 2000; Singer and Lindquist, 1998). In the yeast S. Cerevisiae, trehalose is hydrolyzed into glucose by the action of two types of trehalases: the ‘neutral trehalases’ encoded by NTH1 and NTH2 (Jules et al. , 2008; Mittenbuhler and Holzer, 1988), which are optimally active at pH 7, and the ‘acid trehalase’ encoded by ATH1, showing optimal activity at pH 4. 5 (Destruelle et al. , 1995). Neutral trehalase has been well studied and is known to hydrolyze trehalose in the cytosol. While fungal acid trehalases, including the yeast Candida albicans (Pedreno et al. , 2004) and Kluyveromyces lactis (Swaim et al. , 2008) enzymes, have been reported to be localized at the cell surface, the localization of the S. Cerevisiae acid trehalase is still a matter of controversy. In 1982, Wiemken and coworkers (Keller et al. , 1982) first identified this protein in vacuole-enriched fraction obtained by density gradient centrifugation of a yeast protoplast preparation. Vacuolar localization of acid trehalase was very recently supported by in vivo imaging analyses using GFP-Ath1 fusion constructs under the strong and constitutive TPI1 promoter (Huang et al. , 2007). Furthermore, these authors employed various trafficking mutants to show that this acid trehalase reaches its vacuolar destination through the multivesicular body (MVB) pathway. However, this localization contrasts with the fact that this enzyme allows yeast to grow on exogenous trehalose (Nwaka et al. , 1995b), and with a measurable Ath1 activity at the cell surface (Jules et al. , 2004).