Détection de séquences d'ARN du VHC dans des extraits de moustiques du genre Aedes : étude cinétique après infections expérimentales

par Yassine Rechoum

Thèse de doctorat en Biotechnologie et santé

Sous la direction de Emmanuel Drouet.

Soutenue en 2009

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015) .

mots clés

• Virus de l'hépatite C
• Flavivirus

Résumé

Dans le but d'explorer la capacité des moustiques à répliquer le VHC, nous avons réalisé une série d'infections expérimentales sur Aede caspius, Aedes vexans et genre Cu/ex pipiens sauvage et d'élevage. Après collecte des moustiques, les femelles ont été nourries par un repas sanguin virémique (VHC 1 b positif). Les moustiques ont ensuite été maintenus en élevage pendant plusieurs jours. Après mise au point des conditions de détection, nous avons réussi à apporter la preuve de la réplication du VHC dans les moustiques du genre Aedesvexans. Dans la première infection expérimentale réalisée sur Ae. Vexans , nous avons détecté de l'ARN du VHC dans -50% des moustiques du 21,ème jours post-infection (JPI), par PCR en point final. La seconde expérience d'infection, réalisée sur les deux genres dE moustiques: Aedes Sp, et Cu/ex pipiens, nous a permis de : (i) confirmer par qRT-PCR le résultat de la première expérience avec un tau: d'infection de -33% ; (ii) démontrer que seuls les moustiques du genre Aedes contenaient de l'ARN du VHC, les moustiques du genre Cu/ex étaient tous négatif; (iii) montrer que l'ARN détecté était bien issu de la réplication, dans la mesure où des mutations d'adaptation ont été identifiées dans la séquence de la RdRp (ARN Polymérase ARN dépendante), avec une spécificité pour le genre Aedes, puisque tous les moustiques Cu/ex à 21 JPI étaient ARN VHC-négatifs. Un autre moyen de distinguer l'ARN issu de la réplication de l'A RN résiduel a été de montrer l'existence d'une dissémination au sein du moustique. Pour ce faire, nous avons réalisé une troisième expérience d'infections (genres Ae. Caspius et Ae. Vexans), sur une durée de 15 jours et avons analysé la présence de l'ARN du VHC distinctement dans les têtes et les corps. En effectuant des prélèvements à différentes dates après infection (0, 4, 8 et 15 jours), nous avons réussi à obtenir une cinétique d'infection, séparément, dans les têtes et dans les corps, détection réalisée parWTA (Whole Transcriptome Amplification) suivie de qPCR. Au jour de l'infection (JO), le taux d'infection dans les têtes et les corps des moustiques éta de 9,1 % et 100% respectivement, ce taux est passé à 57,1 % et 85,7% respectivement à J15 après une négativation huit jours après infection. D'autre part, nous avons identifié des mutations d'adaptation dans la séquence de l'IRES des moustiques à J15 comparés à ceux à JO. Il est intéressant de noter que les moustiques ARN VHC-positifs appartenaient tous à l'espèce vexans, montrant ainsi que la réplication est spécifique d'espèce. Différentes régions du génome du VHC ont, ensuite, étaient amplifiées. Enfin, nous avons eu recoun à des moustiques d'élevage. L'infection de cette souche a également montré, en utilisant différentes approches de détection (qRT-PCR, WTA-qPCR, HCV-GA notamment), qu'à 30 JPI, l'ARN du VHC était présent dans -33% des têtes et -66% des corps, alors que les taux d'infection à JO étaient de -28% et -71 % dans les têtes et les corps respectivement. Les résultats se sont appuyés sur des séquençage effectués sur les régions amplifiées du génome du VHC. L'ensemble de ces résultats montrent que le VHC est capable de se répliquer dans les moustiques du genre Ae. Vexans, ce qui suggère que le VHC, à l'image d'autres F/avivirus, puisse alterner entre deux hôtes rimates et moustiQues) et Qu'il ait perdu son potentiel de réplication chez le moustiQue au fil du temps.

Titre traduit

Detection of HCV RNA sequences in Aedes mosquitoes : towards understanding the mechanisms for persistence of endemic Hepatitis C virus (HCV)

Résumé

Ln order to explore the ability of mosquitoes to replicate HCV, we conducted a series of experimental infections caspius on Aedes, Aedes vexans and Culex pipiens wild and farmed. After collection of mosquitoes, the females were fed a blood meal viremic (HCV 1b positive). The mosquitoes were th en maintained in breeding for several days. After development of detection conditions, we were able to demonstrate HCV repli cation in the mosquito Aedes vexans. Ln the first experimental infection performed on Ae. Vexans, we detected HC' RNA in - 50% of mosquitoes 21st days post-infection (JPI), PCR end point. The second infection experiment, conducted on Iwo types of mosquitoes: Aedes SP, and Culex pipiens, has allowed us to: (i) confirmation by qRT-PCR results of the first experience with an infection rate of - 33%, (ii) demonstrate that only the mosquito Aedes contained RNA HCV, the Culex mosquitoes were ail negative, (iii) show that the RNA detected was good of replication, the extent of adaptive mutations were identified in the sequence of the RdRp (RNA polymerasi RNA dependent), with specificity for the genus Aedes, since ail Culex mosquitoes at 21 YPI were HCV RNA-negative. Another way to distinguish RNA from the replication of RNA remaining was to show the existence of a release within the mosquito. To do this, we conducted a third experiment infections (gender Ae. Caspius and Ae. Vexans), over a'period of 15 days and analyzed the presence of HCV RNA in distinct heads and bodies. Ln conducting samples at different times after infection (0, 4, 8 and 15 days), we managed to obtain a kinetic infection separately in heads and bodies, detection performed by WTA (Whole transcriptomics Amplification) followed by qPCR. On the day of infection (DO), the infection rate in the heads and bodies of mosquitoes was 9. 1 % and 100% respectively, the rate rose to 57. 1% and 85. 7% respectively J15 negativity after eight days after infection. On the other hand, we have identified mutations in th adaptation of the IRES sequence of mosquito D15 compared to those on day O. It is interesting to note that mosquito-positive HCV RNA ail belonged to the species vexans, showing that replication is species specific. Different regions of the HCV genome, then, were amplified. Finally, we made use of mosquito breeding. Infection of this strain has also shown, using different approaches to detection (qRT-PCR, qPCR-WTA, including HCV-GA), only 30 JPI, HCV RNA was present in - 33% heads and - 66% of the body, while infection rates were JO - 28% - 71 % in the head and body respectively. The results were based on sequencing performed on the amplified region! of the HCV genome. Ali these results show that HCV is able to replicate in mosquitoes of the genus Ae. Vexans, suggesting that HCV, likt other flaviviruses, can alternate belween Iwo hosts (primates and mosquitoes) and has lost its potential for replication in the mosquito ove time.