Photoluminescent diamond nanoparticles as labels in cells : study of their optical properties and investigation of their cellular uptake mechanism

par Orestis Faklaris

Thèse de doctorat en Sciences physiques

Sous la direction de François Treussart.

Soutenue en 2009

à Cachan, Ecole normale supérieure .

mots clés

• Nanodiamants photoluminescents
• Ndps
• Nanoparticules
• Diamant
• Photoluminescence
• Immunofluorescence

Titre traduit

Nanoparticules de diamant fluorescentes comme marqueurs pour les cellules : étude de leurs propriétés optiques et de leur mécanisme d'internalisation

Résumé

Ce travail de thèse porte sur l'utilisation des NanoDiamants Photoluminescents (NDPs) pour des applications en bio-imagerie. Les nanodiamants (NDs) sont photoluminescents grâce à la présence de centres colorés azote-lacune (NV) dans leur maille cristalline. Le manuscrit est divisé en deux parties. La première concerne l'étude des propriétés optiques des centres colorés NV dans des NDs. Après l'optimisation de la concentration des centres NV, nous comparons la photoluminescence des NDPs à celle des nanoparticules semi-conductrices commerciales; nous concluons qu'elle peut être équivalente, même supérieure dans le cas des NDPs. Pour augmenter le contraste d'imagerie intracellulaire des NDPs, nous avons étudié l'excitation à 2-photons des centres NV. Lors de cette étude avec un laser impulsionnel, nous avons découvert que le signal de photoluminescence des NDPs excité à un photon chute très fortement lorsque l'impulsion infrarouge est simultanée de l'excitation visible. Nous avons étudié la façon d'utiliser cet effet pour l'imagerie de super-resolution. La deuxième partie porte sur l'étude des applications des NDPs comme sondes pour la bio-imagerie. Dans le but d'utiliser des NDPs comme véhicules de biomolécules, nous avons étudié leurs mécanismes d'internalisation et avons élucidé leur localisation intracellulaire, en inhibant des voies différentes d'internalisation et par des expériences d'immunofluorescence. De plus, nous avons montré que les NDPs ne sont pas toxiques pour des cellules en culture. Un premier essai de vectorisation a été mené avec de NDPs couverts d'ADN plasmidique.

Résumé

This thesis work studies the use of Photoluminescent NanoDiamonds (PNDs) for bio-imaging applications. Nanodiamonds are photoluminescent thanks to embedded nitrogen-vacancy (NV) color centers. The thesis is divided in two parts. The first part concerns the study of the optical properties of NV color centers in nanodiamonds. After optimization of the NV center concentration, we compared the photoluminescence of PNDs to commercial Quantum Dots (QDs) and conclude that it can be similar or even higher in the case of PNDs. To enhance the imaging contrast of internalized by cells PNDs, we studied the 2-photon excitation properties of NV centers. While implementing a pulsed excitation laser, we discovered that simultaneous one- and two-photon excitation (IR+VIS pulses) quenches the photoluminescence signal of PNDs. We examined how this effect can serve for super-resolution imaging of NV color centers in nanodiamonds. The second part of the work is devoted to the applications of PNDs as bio-imaging probes. In the prospect of applications of PNDs as drug delivery vehicles, we studied the uptake mechanisms of PNDs and elucidated their intracellular localization by blocking different entry mechanisms and by immunofluorescence experiments. Moreover, we ensured that PNDs are not toxic for cells in culture. As a first try of vectorization we covered PNDs with plasmid DNA and examined the transfection efficiency.