Etude des caractéristiques moléculaires du probiotique Lactobacillus rhamnosus Lcr35 et de son interaction avec des cellules humaines
par Sophie Coudeyras
Thèse de doctorat en Microbiologie
Sous la direction de Christiane Forestier.
Soutenue en 2009
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Résumé
Le microbiote exerce sur la santé humaine des effets bénéfiques essentiels qui peuvent être renforcés par l'administration de probiotiques. Ces micro-organismes vivants qui, selon la définition, administrés en quantité adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l'hôte, sont souvent issus de la flore humaine et appartiennent pour la plupart aux bactéries lactiques, en particulier au genre Lactobacillus. Ainsi la souche probiotique L. Rhamnosus Lcr35 lyophilisée avec son milieu de culture constitue le principe actif de produits pharmaceutiques indiqués dans le traitement des diarrhées et la prévention des vaginites, commercialisés de longue date dans de nombreux pays. L'objectif de notre travail a consisté à caractériser d'un point de vue moléculaire cette bactérie ainsi que ses interactions avec les cellules de l'hôte. L'utilisation de plusieurs techniques de typage moléculaire (séquençage, ribotypage, électrophorèse en gradient de température) a permis d'établir que la souche Lcr35 appartient effectivement à l'espèce L. Rhamnosus, avec une proximité plus grande vis-à-vis du probiotique L. Rhamnosus GG qu'avec la seule souche type de l'espèce. Les profils d'électrophorèse en champ pulsé et d'amplification génique (PCR) basée sur des séquences répétées (rep-PCR) de 2 isolats de Lcr35 issus de lots produits à 40 ans d'intervalle se sont avérés identique montrant l'excellente conservation de la souche au cours du temps. Au contraire, des profils nettement distincts ont été obtenus pour 7 autres souches du groupe des L. Casei par ailleurs phénotypiquement proches. Par une technique d'hybridation soustractive contre le génome de L. Rhamnosus GG, 5 séquences spécifiques de Lcr35, dont 2 phagiques, ont été mises en évidence. L'ensemble des résultats obtenus a conduit à développer des méthodes de PCR et de rep-PCR rapides et discriminantes permettant l'identification de la souche probiotique Lcr35 en routine. Afin de qualifier les mécanismes d'action de ce probiotique, nous avons dans un 1er temps cherché à déterminer quels étaient les gènes bactériens spécifiquement mis en jeu in vivo dans un modèle murin, en utilisant la resolvase-based in vivo expression technology (R-IVET). Bien que cette technique n'ait pas pu être menée à son terme avec succès, les différentes étapes réalisées sont présentées et interprétées dans ce mémoire. Par ailleurs, nous avons montré que L. Rhamnosus Lcr35 est capable d'adhérer rapidement et efficacement à des cellules humaines cervicales et vaginales immortalisées in vitro. Ce probiotique exerce également un effet microbicide vis-à-vis de Prevotella bivia et Gardnerella vaginalis, des pathogènes fréquemment associés aux vaginites bactériennes, ainsi qu'à l'encontre du principal agent des candidoses, Candida albicans. Ces résultats soulignent l'intérêt thérapeutique de la bactérie Lcr35 utilisée comme principe actif dans le traitement et la prophylaxie des affections vaginales microbiennes communes. Enfin, une analyse de la réponse de cellules épithéliales (intestinales et vaginales) et dendritiques humaines in vitro au contact de la souche Lcr35 a révélé des modifications transcriptionnelles significatives, notamment pour les cellules dendritiques. Les principales modifications d'expression concernent des gènes impliqués dans la réponse immunitaire, la présentation des antigènes, la transduction des signaux et - surtout chez les cellules épithéliales - les processus d'adhésion cellulaire. De plus, les modifications des réponses transcriptionnelles observées étaient étroitement corrélées à l'inoculum bactérien mis au contact des cellules, démontrant ainsi une relation effet-dose.
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Titre traduit
Study of the molecular characteristics of the probiotic bacterial strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35 and its interaction with human cells
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Résumé
Microbiota exert essential beneficial effects on human health which can be reinforced by administering probiotics. These live microorganisms which, according to their definition, confer a health benefit on the host when administered in adequate amounts, are often isolated from human flora and most belong to the lactic acid bacteria, in particular to the genus Lactobacillus. Thus, the probiotic strain L. Rhamnosus Lcr35 lyophilized with its culture medium constitutes the active substance of pharmaceutical products that have long been used in the treatment of diarrhoea and prevention of bacterial vaginosis in numerous countries woldwide. The aim of our work consisted in molecular characterization of this bacterium and its interactions with the host cells. Using several molecular typing methods (sequencing, ribotyping, temperature gradient gel electrophoresis), we established that strain Lcr35 belongs to the L. Rhamnosus species with a greater similarity to the probiotic L rhamnosus GG than to the species type strain. Patterns obtained from two isolates of Lcr35 sampled 40 years apart bu pulsed-field gel elctrophoresis and repetitive DNA element-based (rep-)PCR could not be distinguished, showing the excellent preservation of the strain over time. In contrast, seven strains belonging to the L. Casei group displayed clearly distinct patterns, despite being phenotypically close. Subtractive hybridization using the L. Rhamnosus GG genome as a driver revealed five Lcr35-specific sequences, of which two were phage-related. On the basis of these findings, rapid and discriminative PCR and rep-PCR methods for routine identification of the probiotic dtrain Lcr35 were developed. In order to qualify the mechanisms of action of this probiotic strain, we first tried to determine which genes were specifically involved in vivo in a murine model, using resolvase-based in vivo expression technology (R-IVET). Although this technique could not be carried through all its stages, those successfully completed are presented and commented on. We also showed that L rhamnosus Lcr35 was able to adhere rapidly and efficiently to immortalized human cervical and vaginal cells in vitro. The strain exhibited microbicidal activity against Prevotella bivia and Gardnerella vaginalis, pathogens frequently involved in bacterial vaginosis, and against the common fungal pathogen Candida albicans, the main causative agent of candidiasis. It is of interest, therefore, as a therapeutic agent for the treatment and prevention of common vaginal infection disorders. Finally, analysis of the response of human epithelial (intestinal and vaginal) and dentritic cells in vitro to contact with strain Lcr35 showed significant transcriptional modifications, especially ofr the dendritic cells. The main modifications in expression affect genes involved in immune response, antigen processing and presentation, signal transduction and - particularly in epithelial cells - cell adhesion processes. The modifications in transcriptional responses observed in the human cells were closely correlated to the bacterial inoculum in contact, thus demonstrating a dose-effect relationship.
