Apoptose du spermatozoïde et fertilité masculine

Apoptosis of spermatozoa and male fertility

• Auteur / Autrice : Florence Baume Brugnon
• Direction : Geneviève Grizard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie de la reproduction
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Clermont-Ferrand 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Injection intracytoplasmique de spermatozoïdes

Stérilité masculine

Spermatogenèse

Spermatozoïdes

Apoptose

Résumé

Pour mieux comprendre la signification des marqueurs d'apoptose dans les spermatozoïdes éjaculés humains, l'objectif de notre étude était de mesurer ces marqueurs dans les spermatozoïdes prélevés à différents niveaux du tractus génital masculin dans différentes situations physiopathologiques. Pour évaluer la qualité fonctionnelle de ces spermatozoïdes, des relations ont été recherchées entre l'expression de ces marqueurs et les résultats obtenus en assistance médicale à la procréation. Les marqueurs analysés sont des facteurs mis en jeu dans l'initiation et l'activation de l'apoptose (poly-caspases, caspase-3, -8 ou -9 activée(s)), et des signes précoces (externalisation de la phosphatidylsérine, PS) ou tardifs (fragmentation de l'ADN) de l'apoptose. Pour certains échantillons, une analyse ultrastructurale des spermatozoïdes a aussi été réalisée. La mesure de l'expression des caspases activées a fait l'objet d'une mise au point compte-tenu de l'hétérogénéité des populations spermatiques et de la faible quantité de spermatozoïdes disponibles. Finalement, nous avons retenu une mesure par double marquage associant un inhibiteur fluorescent vert des caspases activées et un colorant fluorescent rouge (Propidium Iodide) avec une détection soit en cytométrie en flux soit en microscopie à fluorescence selon la nature des spermatozoïdes analysés. Chez des patients présentant une agénésie bilatérale des canaux déférents, la proportion de spermatozoïdes vivants ou morts exprimant des caspases activées est plus élevée dans les spermatozoïdes testiculaires que dans les spermatozoïdes épididymaires suggérant une initiation du processus apoptique dans les testicules et une incapacité des spermatozoïdes épididymaires à initier l'apoptose. Dans ces conditions, en ICSI, le risque d'injecter un spermatozoïde apoptique dans un ovocyte est plus élevé avec les spermatozoïdes testiculaires et pourrait expliquer pour une part, les résultats de moins bonne qualité avec ces spermatozoïdes testiculaires qu'avec les spermatozoïdes épididymaires. Chez des patients infertiles, porteurs d'une translocation chromosomique réciproque ou Robertsonienne autosomique, il existe une expression plus importante des modifications ultrastructurales et des marqueurs biochimiques d'apoptose (caspases activées, fragmentation de l'ADN, externalisation de la PS) associée à des signes d'immaturité ultrastructurale, comparé aux spermatozoïdes d'hommes fertiles. Ces résultats pourraient expliquer que dans l'éjaculat de ces patients, il existe une prédominance de gamètes équilibrés sur le plan chromosomique. En effet, les gamètes présentant un déséquilibre auraient été éliminées préférentiellement par apoptose. En conclusion, les marqueurs d'apoptose exprimés par les spermatozoïdes éjaculés seraient le reflet d'une altération de la spermatogenèse avec une apoptose initiée et avortée dans le testicule associée à des anomalies de maturation et différentiation. La mesure des marqueurs d'apoptose dans les spermatozoïdes apporterait une aide dans la compréhension et la prise en charge de l'infertilité masculine, en particulier en assistance médicale à la procréation.

In order to have a better insight into the implications of apoptosis markers in human ejaculated spermatozoa, the aim of our study was to measure these markers in the spermatozoa collected at different levels in the male genital tract in various physiopathological situations. To analyse the functional quality of these spermatozoa, the analysis of relationships between the expression of these markers and the results obtained after assisted reproductive technology was assessed. The markers analysed are factors that are involved in the initiation and activation of apoptosis (activated poly-caspases, caspases-3, -8, -9) and early (externalisation of phosphatidylsérine, PS), or late (DNA fragmentation) signs of apoptosis. Ultrastuctural analysis of the spermatozoa was also carried out for some samples. Measurement of the expression of activated caspases was subject of adjustment given the heterogeneity of the sperm samples and the low quantity of spermatozoa available. Finally, we decided on measurement using a double staining associating a green fluorescent inhibitor for the activated caspases and a red fluorescen vital staining (Propidium Iodide), with detection either by flow cytometry or by fluorescent microscopy depending on the type of spermatozoa to be analysed. In patients presenting congenital bilateral absence of vas deferens, the proportion of living or dead spermatozoa expressing activated caspases was higher in the testicular spermatozoa than in the epididymal spermatozoa suggesting that the apoptotic process started in the testicles and that epididymal spermatozoa were incapable of initiating apoptosis. Under these conditions, in case of ICSI, the risk of injecting an apoptotic spermatozoa into an ovocyte is higher with the testicular spermatozoa and could explain, in part, the different and inferior results obtained with these testicular spermatozoa, compared with epididymal spermatozoa. In the ejaculated spermatozoa of infertile reciprocal or Robertsonian autosomal translocation carriers, the expression of ultrastructural modifications and biochemical markers of apoptosis (activated caspases, DNA fragmentation, PS externalisation) associated with signs of ultrastructural immaturity was higher than in spermatozoa of fertile men. These results could explain that in the ejaculate of these patients, there is a predominance of chromosomal balanced spermatozoa. The gametes presenting an imbalance would have been preferentially eliminated by apoptosis. In conclusion, the apoptosis markers expressed by ejaculated spermatozoa would reflect the impairment of spermatogenesis with apoptosis initiated and aborted in the testicle associated with maturation and differentiation abnormalities. So measurement of apoptosis markers in spermatozoa could be helpful for the understanding of male infertility, particularly to predict the outcome of assisted reproductive technologies.