Mécanismes moléculaires de résistance au sulfaméthoxazole chez Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple

Molecular mechanisms of resistance to sulfamethoxazole in Tropheryma whipplei, the agent of Whipple's disease

• Auteur / Autrice : Nawal Bakkali
• Direction : Jean-Marc Rolain
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Maladies transmissibles et pathologies tropicales
• Date : Soutenance en 2009
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université d'Aix-Marseille II. Faculté de médecine (1970-2011)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tropheryma

Sulfadiazine

Résistance au triméthoprime

génétique

Multirésistance bactérienne aux médicaments

Association triméthoprime-sulfaméthoxazole

Sulfaméthoxazole

Triméthoprime

Maladie de Whipple

Résumé

Les bactéries intracellulaires strictes, de par leur localisation, sont difficiles à neutraliser par les antibiotiques. Dans une première partie nous présentons une revue exhaustive des mécanismes moléculaires associés à la résistance aux antibiotiques et des tentatives de manipulation génétique chez les bactéries intracellulaires. Notre travail de recherche s’est intéressé à l’une d’entre elles: Tropheryma whipplei, l’agent de la maladie de Whipple. Durant le traitement de cette maladie, la combinaison sulfaméthoxazole/triméthoprime est administrée. Un travail récent au laboratoire a démontré l’inefficacité in vitro du triméthoprime du fait de l’absence du gène cible folA dans le génome bactérien. Des cas d’échecs thérapeutiques à ce traitement ainsi que des rechutes ont été également rapportés dans la littérature suggérant la possibilité d’acquisition de résistance au sulfaméthoxazole au cours du traitement. Le 1er objectif de notre travail a été d’étudier le mécanisme moléculaire de la résistance au sulfaméthoxazole chez T. Whipplei. La séquence du gène folP codant pour la cible du sulfaméthoxazole : la dihydropteroate synthase (DHPS) a été obtenue à partir d’isolats cliniques de T. Whipplei et également à partir de prélèvements positifs en PCR d’un patient en échec thérapeutique avant et après le début de son traitement. Les séquences obtenues chez ce patient ont mis en évidence plusieurs mutations par rapport aux séquences obtenues à partir des isolats cliniques de T. Whipplei. L’analyse de ce gène a révélé que chez T. Whipplei folP fait partie d’un gène codant pour une enzyme trifonctionnelle dans laquelle DHPS est combinée avec les 2 enzymes qui la précèdent dans la voie classique de biosynthèse des folates. La complémentation d’une souche d’Escherichia coli knock-out pour le gène folP, par la séquence mutée de folP associée à l’échec thérapeutique a non seulement restauré la fonction de DHPS et par conséquent la voie de biosynthèse des folates mais a aussi induit une résistance au sulfaméthoxazole par rapport à la séquence sauvage. Nous avons ainsi démontré pour la première fois que la séquence mutée de ce gène se traduisant par une séquence protéique différente induisait une résistance in vitro au sulfaméthoxazole et pouvait expliquer les échecs et rechutes observés au cours du traitement de cette maladie. La deuxième partie de cette thèse a porté sur l’évaluation de la sensibilité de T. Whipplei in vitro à un autre sulfamide: la sulfadiazine. Au vu des résultats obtenus et des propriétés pharmacologiques de ce composé, nous proposons son utilisation comme traitement de la maladie de Whipple en alternative à la combinaison de sulfaméthoxazole et de triméthoprime dans les formes neurologiques en association avec la doxycycline et l’hydroxychloroquine.

Obligate intracellular bacteria, by their intracellular location, are difficult to neutralize by antibiotics. In a first part, we present a review of molecular mechanisms of resistance to antibiotics and attempts at genetic manipulation of intracellular bacteria. Our work has focused on one of them: Tropheryma whipplei, the agent of Whipple's disease. The recommended empirical treatment for this disease involves the simultaneous administration of sulfamethoxazole and trimethoprim (cotrimoxazole). A recent work in our laboratory has demonstrated the ineffectiveness of trimethoprim in vitro because of the absence of its target gene, folA coding for DHFR in the genome of the bacterium. Cases of treatment failures with this treatment and relapses were also reported in the literature suggesting the possibility of acquiring resistance to sulfamethoxazole during treatment. The 1st objective of this thesis was to study the molecular mechanism of antibiotic resistance of T. Whipplei to sulfamethoxazole. The sequence of folP the encoding gene of sulfamethoxazole’s target: the dihydropteroate synthase (DHPS) was obtained from clinical isolates of T. Whipplei and also from positive samples from a patient with treatment failure before and after starting treatment. The sequences obtained from this patient showed several mutations compared to sequences obtained from other strains of T. Whipplei. Gene analysis showed that folP was identified among genes encoding a unique trifunctional enzyme in which DHPS is combined with the 2 preceding enzymes of the folate biosynthesis pathway. Sequencing showed multiple mutations in folP gene in the patient case. Complementation of an Escherichia coli strain knockout for folP with sequence associated with treatment failure has not only restored the folate biosynthesis pathway but also induced resistance to sulfamethoxazole compared with the wild sequence. We also demonstrated for the first time that the mutated sequence of this gene has led to a different protein sequence and induced resistance in vitro to sulfamethoxazole and could explain the failures and relapses observed during the treatment of this disease. The second part of this thesis has focused on assessing the susceptibility of T. Whipplei in vitro to another sulfonamide: the sulfadiazine. Given the results obtained and the pharmacological properties of this compound, we propose its use as an alternative to the cotrimoxazole in combination with doxycycline and hydroxychloroquine in neurological involvement.