Nouvelles sondes phosphorées adaptées à la mesure du pH et du stress oxydant par RMN du 31-P et par RPE en milieu cellulaire

par Gaëlle Gosset

Thèse de doctorat en Chimie moléculaire. Physico-chimie, Analyse, Synthèse molécules bioactives

Sous la direction de Sylvia Pietri.

Soutenue en 2009

à Aix-Marseille 1 , en partenariat avec Université de Provence. Section sciences (autre partenaire) .

mots clés

• Sondes moléculaires
• Résonance paramagnétique électronique
• Stress oxydatif
• pH -- Mesure
• Radicaux aminoxyles

Résumé

Une série de sondes moléculaires diamagnétiques (a-aminophosphonates, nitrones cycliques b-phosphorylées) et paramagnétiques (nitroxydes b-phosphorylés) assurant la mesure spectrale du pH (RMN du 31-P et RPE) et de la production de radicaux libres (Spin Trapping) dans les milieux biologiques ont été synthétisées et leur efficacité évaluée in vitro et, pour les plus performantes, ex vivo. Les meilleures sondes des pH acides (1<pKa<8) offrent une sensibilité RMN 3-4 fois meilleure que celle des marqueurs précédemment connus. Des modèles mathématiques semiempiriques ont permis de corréler les caractéristiques des titrages par RMN (pKa, déplacements chimiques des formes acide et basique) aux paramètres expérimentaux (température, milieu) et structuraux (substitution de l’azote et du phosphore, et variation de la géométrie). Les constantes caractéristiques de la relaxation (T1 et T2) ont également été déterminées dans différentes conditions. Le fort potentiel du nitroxyde stable et cristallisé MELANO comme marqueur du pH par RPE (variation des couplages hyperfins aN, aP et aHb) a été évalué in vitro et a permis une mesure précise du pH de l’estomac de rat après divers traitements pharmacologiques. Les caractéristiques spectrales des adduits de piégeage de radicaux centrés sur O, C ou S de nouvelles D1-pyrrolines N-oxyde portant en b un ligand 1,3-dioxaphosphirane ont été déterminées en milieu aqueux. L’accent a été mis sur la persistance de l’adduit du radical superoxyde et la stéréosélectivité de la formation des diastéréoisomères cis/trans de l’adduit du radical hydroxyle, cette dernière propriété ayant pu être reliée à sa source de production.

Titre traduit

New phosphorylated probes for the 31-P and ESR spectroscopic assessment of pH and oxidant stress in biological milieu

Résumé

A series of molecular probes, either diamagnetic (aminophosphonates, b-phosphorylated cyclic nitrones), or paramagnetic (b-phosphorylated nitroxides) has been synthesized for the spectroscopic measurement of either pH (by 31-P NMR or ESR) or free radical formation (Spin Trapping) in biological milieu and their efficacy has been evaluated in vitro and, for the better ones, in ex vivo models. The best probes for determining acidic pH values (1<pKa<8) showed a 3-4-fold increased sensitivity as compared to previously reported compounds. Semi-empirical models allowed to correlate the main caracteristics of NMR titrations (pKa, chemical shifts of the acidic and basic forms) with experimental (temperature, milieu) and structural (substituents around N and P, changes in geometry) parameters. The main relaxation values (T1 and T2) were also measured under different conditions. The potential of stable, cristallized nitroxide MELANO as enhanced ESR pH marker (from the variation of hyperfine splitting constants aN, aP and aHb) has been assessed in vitro and allowed the reliable determination of pH in rat stomach following various pharmacological treatments. The spectral features of the spin adducts of typical O-, C- or S-centered radicals on a series of D1-pyrrolines N-oxyde bearing a b-(1,3-dioxaphosphirane) ligand have been determined in aqueous medium. Attention has been paid on the persistency of superoxide radical adducts and on the stereoselectivity of the formation of cis/trans diastereoisomers of hydroxyl radical adducts, and this latter property could be related to the spin adduct source.