Etude du mécanisme de transposition de la séquence d'insertion bactérienne IS608

par Catherine Guynet

Thèse de doctorat en Microbiologie et génétique moléculaires

Sous la direction de Mick Chandler et de Bao Ton-Hoang.

Soutenue en 2008

à Toulouse 3 .

mots clés

• Recombinaison
• Plasticité génomique
• Transposition
• Séquence d'insertion
• ADN simple brin
• Transposase
• Cristallographie
• Spécificité d'insertion
• Recombinaison génétique
• Génétique bactérienne
• Transposons

Résumé

Les transposons jouent un rôle fondamental dans la plasticité et l'évolution des génomes bactériens. Ce mémoire concerne l'étude du mécanisme de transposition de l'un d'entre eux, la séquence d'insertion IS608 isolée chez Helicobacter pylori. IS608 appartient à une famille de transposons atypiques, le groupe IS200/IS605, dont les membres sont fortement représentés chez les eubactéries et les archae. Nos travaux mettent en évidence une nouvelle classe de transposases et un mécanisme de transposition inédit. Nous montrons que, à la différence de tous les autres systèmes de transposition connus, la transposase d'IS608 est active uniquement sur un ADN simple brin. Nous avons développé un système de recombinaison qui reconstitue toute les étapes de clivages et transferts de brin nécessaires à la transposition d'IS608 in vitro. TnpA ne ressemble à aucune transposase caractérisée, mais s'apparente aux endonucléases de la superfamille HUH, qui inclue des protéines impliquées dans l'initiation de la réplication en cercle roulant et la réplication de certains virus eucaryotes (protéines Rep), et dans le transfert de plasmides conjugatifs (relaxases). Nous montrons que la fixation d'un ADN approprié induit l'activation de TnpA, sélectionne le site de clivage, et dirige l'intégration dans une cible spécifique. Ces résultats apportent des éléments concernant la sélection de la séquence cible, et nous possédons les outils permettant de modifier la spécificité d'insertion de l'élément.

Titre traduit

Study of transpositionnal mechanism of the IS608 bacterial insertion sequence

Résumé

Transposons play a fundamental role in genome plasticity and evolution of bacterial genomes. This manuscript concerns the study of one of these, the insertion sequence IS608 isolated from Helicobacter pylori. IS608 belongs to an atypical family, the IS200/IS605 group, whose members occur very frequently in the genomes of both eubacteria and archaea. Our results have revealed a new class of transposases and a novel transpositionnal mechanism. We have shown that unlike any other known transposition system, TnpA strictly requires single strand DNA. We have developed a system which reconstitutes the entire set of transposition cleavage and strand transfer reactions of IS608 in vitro. TnpA does not resemble any of the previously characterised transposases but belongs to the superfamily of HUH endonucleases, which includes proteins involved in initiating rolling circle replication and replication of certain eukaryotic viruses (Rep) as well as proteins involved in initiating plasmid conjugative transfer (relaxases). We have demonstrated that an appropriate DNA substrate induces activation of TnpA, selects the cleavage site and drives integration into a specific target. These results have provided insights into the sequence-specific integration process, and we possess the tools which enable us to change the insertion specificity of the element.