Étude du mécanisme catalytique de la thymidylate synthase ThyX de Chlamydia trachomatis et découverte d'inhibiteurs des ThyX par criblage aléatoire de banques de petites molécules

par Yap Jean-Bertrand Boum II

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Hannu Myllykallio.

Soutenue en 2008

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Thymidylate synthase
• Thyx
• Thya
• Inhibiteurs
• Mécanisme catalytique
• Saxs
• Screening
• Helicobacter pylori

Résumé

Les thymidylates synthases ThyA et ThyX sont responsables de la formation du thymidylate (dTMP), un précurseur essentiel à la synthèse de l’ADN. Ces deux enzymes diffèrent au niveau de leur séquence, de leur structure et de leur mécanisme. ThyX est absente chez l’Homme mais présente chez un grand nombre de bactéries pathogènes pour l’Homme telles que, Helicobacter pylori, Mycobacterium tuberculosis et Chlamydia trachomatis. Ces différences ont fait de ThyX une cible thérapeutique prioritaire, validée par l’OMS dans la recherche de nouveaux antimicrobiens pour la lutte contre la tuberculose. ThyA est active sous la forme de dimère, tandis que ThyX est proposée comme étant active sous la forme de tétramère. Elles diffèrent également au niveau de leur mécanisme réactionnel, ThyX est une flavoprotéine et utilise le NADPH comme cofacteur. Bien que le modèle de mécanisme catalytique de type séquentiel soit proposé pour les deux familles d’enzyme, le modèle de type ping-pong est proposé pour ThyX de C. Trachomatis. L’objectif de mon travail était d’étudier le mécanisme catalytique de ThyX de C. Trachomatis, d’évaluer le rôle des résidus conservés dans la famille des ThyX sur l’activité catalytique de ThyX de M. Tuberculosis, et de découvrir de nouveaux inhibiteurs des ThyX. Les résultats de mes travaux me permettent de proposer que la ThyX de C. Trachomatis suit un modèle catalytique de type séquentiel, tel qu’il est proposé pour les autres membres de la famille des Thyx. Les analyses réalisées par diffusion de rayon X aux petits angles (SAXS), m’ont permis d’observer un équilibre en solution entre les formes dimériques, tétramériques et hexamériques de ThyX de C. Trachomatis. Ces résultats montrent que ThyX est également active sous la forme de dimère, comme peut l’être ThyA. J’ai confirmé le rôle essentiel des résidus très conservés du « motif thyX » dans l’activité catalytique de ThyX de M. Tuberculosis. Les résultats obtenus ont contribué à l’extension de ce motif à la séquence (Y/W)X19-40RHRX7-8SXR(Y/F)X68-114R. L’optimisation et la validation des tests permettant de mesurer l’activité de ThyX, m’ont permis de cribler quatre banques de 2610 molécules sur les ThyX de Paramecium bursaria chlorella virus 1, d’H. Pylory, de M. Tuberculosis, de Borellia hermsei et de C. Trachomatis. J’ai identifié six molécules qui ont un effet inhibiteur sur la ThyX de ces cinq espèces bactériennes, et n’ont aucun effet sur la ThyA humaine. Ces six molécules ont également un effet antimicrobien sur un organisme possédant ThyX (H. Pylori), sur un organisme possédant à la fois ThyX et ThyA (M. Smegmatis), et n’ont aucun effet sur un organisme ne possédant que ThyA (E. Coli).

Titre traduit

Study of catalytic mechanism of Chlamydia trachomatis thymidylate synthase thyx, and discovery of novels inhibitors of thyx identified by automated screening

Résumé

Thymidylate synthases, ThyA and ThyX, are enzymes responsible for the formation of the thymidylate (dTMP), an essential precursor in the synthesis of DNA. These two enzymes are different in their sequence, their structure and their mechanism. ThyX is absent in human but present in a large number of human pathogenic bacteria such as: Helicobacter pylory, Microbacterium tuberculosis, C. Trachomatis and many others. The differences of mechanism, structure and distribution of these enzymes, made the World Health Organization define the ThyX as a priority therapeutic target in the discovery of new antimicrobial agent against tuberculosis. ThyA is functionally active as a dimer, whereas ThyX is proposed to be a tetramer in its active form. They also differ mechanistically; ThyX is a flavindependent protein and use NADPH as a cofactor, while ThyA de not. Although sequential mechanism model is proposed for both families of enzyme, the ping-pong type model is proposed for Chlamydia trachomatis ThyX. The aim of my work was to study the mechanism of C. Trachomatis ThyX, to evaluate the role of residues conserved among this family on the catalytic activity of M. Tuberculosis ThyX, and to discover new inhibitors of ThyX. The outcome of my work allows me to propose that ThyX of C. Trachomatis follows a catalytic sequential type model, such as the other members of ThyX family. Small angle x-ray scattering (SAXS) analyses allowed me to observe equilibrium in solution between the dimer, tetramer and hexamer form of C. Trachomatis ThyX. These results show that ThyX is also active as dimer form like ThyA. I have confirmed the essential role of residues of the “ThyX motif” in the catalytic activity of tha ThyX of M. Tuberculosis. The obtained results contributed to the extension of this “ThyX motif” to the sequence (Y/W)X19-40RHRX7-8SXR(Y/F)X68-114R. The optimization and validation of the oxidation test and deprotonation test which allow the measurement of ThyX activity, led me to screen four libraries for a total of 2610 compounds against ThyX of Paramecium bursaria chlorella virus 1, M. Tuberculosis, Borellia hermsei, and C. Trachomatis. I have identified six inhibitors of ThyX activity from these five organisms which also de not inhibit human ThyA. These six molacules also have an antimicrobial effect on a bacteria species possessing ThyX (e. G. H. Pylori MIC~1,25-2,5μg/ml), on a bacteria species possessing both ThyX and ThyA (M. Smegmatis), and have no effect on a bacteria species possessing ThyA (E. Coli).