Thèse soutenue

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Auteur / Autrice : Sebastian Flisiak
Direction : Marc MirandeMahel ZeghoufJacqueline Cherfils
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences biologiques. Ingénierie des protéines
Date : Soutenance en 2008
Etablissement(s) : Paris 11
Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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Rôle de la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale humaine dans la réplication du VIH-1. La transcriptase inverse codée par le génome du VIH-1 utilise l’ARNt3Lys de la cellule-hôte pour amorcer la transcription inverse de son génome ARN en ADN proviral. Il existe trois isoformes de la lysyl-ARNt synthétase humaine (LysRS), toutes les trois codées par le même gène : les formes cytoplasmique (cLysRS), mitochondriale (mLysRS) et pré-mitochondriale (pmLysRS). L'espèce pmLysRS est le précurseur de mLysRS qui est clivé après import dans la mitochondrie. Il a été montré au laboratoire que la LysRS mitochondriale est sélectivement encapsidée dans les particules du VIH-1 et pourrait donc être responsable du transport des ARNtLys au cours du processus d’encapsidation. Au cours de ce travail, nous avons exprimé, purifié, et analysé les capacités de ces trois formes enzymatiques à former un complexe avec l'ARNt. Les résultats décrits dans ce mémoire montrent que les formes mLysRS et pmLysRS purifiées ont la capacité d'aminoacyler l’ARNtLys aussi bien que la forme cytoplasmique de l'enzyme. Nous avons recherché quelles protéines virales pourraient s'associer à la LysRS et à l'ARNtLys pour former le complexe d'encapsidation de l'ARNtLys,3. Par le système du double-hybride, nous avons montré que la protéine Gag n’interagit avec aucune des trois formes de LysRS. Mais nous avons observé que toutes les isoformes de LysRS interagissent avec Pol, un précurseur polyprotéique de HIV-1. Ces données montrent que mLysRS/pmLysRS pourrait former le complexe d'encapsidation de l'ARNt par interaction avec GagPol, et servirait à transporter l'ARNtLys,3. Nos resultats suggèrent aussi qu'un autre facteur est impliqué dans la formation d'un complexe spécifique entre Pol et mLysRS ou pmLysRS pour l’encapsidation de l'ARNt dans las particules virales. Caractérisation de l’inhibition d’un nouveau mutant de la GTPase Arf. Les petites protéines G de la famille Arf sont des régulateurs majeurs du trafic cellulaire chez les eukaryotes. Il a été montré récemment que les protéines Arf sont impliquées dans des cancers ou bien des maladies infectieuses lorsqu'elles sont dérégulées. Les Arfs sont activées par l’échange GDP/GTP, échange stimulé par leurs facteurs d'échange nucléotidique (GEFs). Les GEFs sont donc de bons candidats pour bloquer spécifiquement les voies de signalisation correspondantes. Le premier inhibiteur de GEF connu a été le macrolide fongique bréfeldine A (BFA). Son mécanisme d’inhibition a été appelé inhibition interfaciale et constitue un concept prometteur pour la découverte de nouveaux inhibiteurs. Grâce à ce concept, la petite molécule inhibitrice LM11 a été découverte par criblage in silico en utilisant la structure cristallographique du complexe Arf1-GDP/ARNO qui a été précédemment résolue dans notre laboratoire. La fixation de LM11 dans la cavité criblée a été précédemment analysée par des mutations d’ARNO et par RMN HSQC d’Arf1-GDP. Dans ce travail, j’ai étudié la contribution de Lys38 dans Arf1, résidu dont le déplacement chimique est affecté en RMN HSQC par la présence de l’inhibiteur LM11. J’ai utilisé la mutagenèse dirigée pour construire un nouveau mutant d’Arf1, Arf1K38A. Ce mutant a été exprimé, purifié et analysé pour son activité d’échange et sa sensibilité à l’inhibiteur. On a montré que le résidu K38 d’Arf1 est crucial pour le mécanisme d’inhibition de LM11, mais reste sensible à la BFA. Dans la deuxième partie de mon travail, j’ai construit, exprimé et purifié la forme entière d’Arf4, un membre de la classe II des Arfs, dont les propriétés biochimiques sont mal caractérisées.