Design of vector for the expression of shRNA in transgenic animals

par Ashraf Sawafta

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Louis-Marie Houdebine.

Soutenue en 2008

à Paris 6 .

mots clés

• SiRNA [short interfering RNA]
• MiRNA [microRNA]
• Gène IE [Immediate Early gene]
• Knockdown
• Virus de la pseudo rage porcine
• Cellules CHO [Chinese hamster ovary cells]
• Souris transgéniques

Titre traduit

Mise au point de vecteurs permettant une expression fiable de gènes codant pour des ARN interférent et des microRNA

Résumé

Small interfering RNAs (siRNAs) are still rarely used in transgenic vertebrates to knockdown gene expression. Indeed, the in vitro highly efficient expression vectors for siRNA based on the use of polymerase III promoters as U6 or H1 gene promoters for expression in cells are often silenced in vivo. In this thesis, various shRNA expressing vectors have been used in cultured cells and in transgenic mice to inhibit the IE (Immediate Early gene) mRNA from the pig pseudo-rabies virus responsible for Aujeszky disease. The amount and the sequence of produced siRNA were studied by qPCR. In transiently transfected CHO cells, vectors containing the U6 gene promoter (U6-shRNA) were by far the most efficient to inhibit IE mRNA, mainly due to the very high level of produced siRNA. Besides, two constructs encompassing a RNA polymerase II promoter (EF-1α) upstream of either the miR30 skeleton containing IE sequence or the IE sequence bordered by 5T induced a significant but moderate inhibition. This could be related to the low siRNA production by these two constructs. Notably, despite the fact that the sequence of the siRNA was shorter than expected with the miR30 construct, this did not affect its efficiency. The three constructs were then used to generate transgenic mice. Transgenic mice harbouring an intact transgene were obtained only with the miR30 construct. The absence of U6-shRNA or 5T transgenic mice could result from a potent off-targeting effect of the siRNA sequence produced with these two constructs that was not the case with the miR30 construct producing shorter siRNA. These transgenic mice were subjected to viral infection. Although the level of miRNA production was low within the cells and tissues of these transgenic animals some of these mice were capable to resist the viral infection by Aujeszky virus. The second part of this work was to select new target sequence within the different regions on the IE mRNA sequence. Several constructs were evaluated among which two sequences were capable to induce inhibition of reporter gene expression. These two new sequences which are targeted the 5’UTR region of IE mRNA and the 3’UTR region of IE mRNA are currently under further investigation for preparation of transgenic mice. The data suggest that (1) the efficiency of a siRNA producing construct is determined by its sequence in an only predictable manner (2) the efficiency of a siRNA is higher when the targeted region of the mRNA is not in secondary structure (3) a potent and optimal siRNA effect may occur even at low concentration of siRNA when it is well targeted on mRNA sequence and to the amount of the siRNA, (4) off-targeting activity of siRNA may occur even at low concentration but it may be increased at high concentration (5) a siRNA to be used in transgenic animals should be designed in such a way to be potent even at low concentration to reduce the side effects.

Résumé

Les petits ARN interférents (siRNA) sont encore rarement utilisés chez les vertébrés transgéniques pour inhiber l’expression de gènes. En effet, les vecteurs contenant un promoteur de type ARN polymérase III comme ceux des gènes U6 et H1 qui permettent une expression élevée des gènes codant pour des ARNi dans des cellules sont souvent silencieux in vivo. Dans cette thèse, divers vecteurs exprimant des petits ARN double brins (shRNA) ont été testés dans des cellules en culture et chez des souris transgéniques pour inhiber l’ARN m du gène précoce IE du virus de la pseudo rage porcine responsable de la maladie d’Aujeszky. La quantité et la séquence des si RNA produits ont été étudiées par qPCR. Dans des cellules CHO transfectées pour une expression transitoire, les vecteurs contenant les gènes U6-shRNA ont été de loin les plus efficaces pour inhiber le gène IE en raison du niveau élevé de siRNA produit. Par ailleurs, deux constructions contenant le promoteur de type ARN polymérase II, le promoteur du gène eF1-α etune séquence de shRNA bordée par 5T ou introduite dans un gène de microARN (miRNA) le miR30 ont permis d’obtenir une inhibition significative mais limitée de l’ARNm du gène IE. Ceci parait être du au niveau relativement faible de siRNA produit. Le siRNA produit par le gène du miRNA s’est avéré aussi efficace que ceux obtenus à partir des constructions U6-shRNA bien que ces derniers soient un peu plus longs. Ces diverses constructions ont été utilisées pour obtenir des souris transgéniques. Des souris contenant la séquence du shRNA n’ont pu être obtenues qu’à partir de la construction miRNA. Ceci peut être du au fait que les siRNA produits par les autres constructions ont exercé un effet inhibiteur sur des cibles aspécifiques (off-targeting) qui ne s’est pas produit avec le siRNA provenant de la construction miRNA car il contient quelques nucléotides en moins. Les souris transgéniques contenant la construction miRNA ont été soumises à une infection par le virus de la pseudo rage porcine. Bien que les souris exprimaient le gène shRNA qu’à un faible niveau. Quelques souris transgéniques ont résisté à l’infection. La seconde partie de la thèse a consisté à sélectionner d’autres séquences de shRNA capables d’inhiber l’expression du gène IE sans exercer des effets aspécifiques. Deux séquences de shRNA ont permis une telle inhibition. L’une est dirigée contre la région 5’UTR du gène IE et l’autre contre la région 3’UTR. Ces données suggèrent que (1) l’efficacité d’un shRNA n’est pas déterminée par sa séquence d’une manière totalement prévisible (2) l’efficacité d’un siRNA est d’autant plus élevé que sa séquence cible dans l’ARNm est en structure double brin (3) un effet inhibiteur intense et optimum peut être obtenu avec des concentrations faibles d’un siRNA (4) les effets secondaires et en particulier le off-targeting peuvent avoir lieu à faible concentration du siRNA mais ils ont d’autant plus de chance de se produire que la concentration du si RNA est plus élevée (5) un siRNA destiné à être utilisé chez des animaux transgéniques devrait être choisi pour sa capacité à inhiber efficacement un gène à faible concentration pour réduire ses effets secondaires.