Mise au point d'une méthode utilisant des biopuces pour le diagnostic de Neuropathies Héréditaires
par Yasser Baaj
Thèse de doctorat en Biologie - Sciences - Santé. Médecine
Sous la direction de Franck Sturtz.
Soutenue en 2008
à Limoges .
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Résumé
La méthode de puce à ADN devient progressivement répandue et attrayante pour le diagnostic moléculaire et le génotypage des mutations. Les améliorations de cette méthode se sont principalement focalisées sur l'augmentation de sa fiabilité. Nous rapportons, dans l'étude présente, le développement d'une méthode de génotypage où une puce à ADN portant des sondes dites « en épingle à cheveux » ("hairpin") dont la structure présente une tige et une boucle. Cette puce a été particulièrement conçue pour optimiser la spécificité d'hybridation des séquences complémentaires d'ADN. Nous avons employé cette méthode pour détecter plusieurs mutations impliquées dans une pathologie neurologique appelée la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). L'ADN de témoins et de patients ont été amplifiés et marqués par PCR et ensuite hybrides sur des puces à ADN. Les intensités de signal des sondes sauvages étaient considérablement plus élevées que leurs sondes homologues mutantes différant par un seul nucléotide (taux de discrimination) pour l'ADN normal ("homozygote"). D'autre part, pour les échantillons d'ADN muté ("hétérozygote"), les intensités des signaux étaient approximativement équivalents pour les sondes sauvages et mutées (taux de discrimination proche de un aux positions de mutations). Ces résultats ont été obtenus avec des produits de PCR individuellement amplifiés, ou avec des produits de PCR multiplexe. Notre méthode de puce à ADN permet un génotypage très spécifique en combinant les sondes "hairpin" et la PCR multiplexe.
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Titre traduit
Development a of microarray method for the diagnosis of hereditary neuropathies
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Résumé
Microarray method is becoming increasingly widespread and attractive for molecular diagnosis and mutations genotyping. Improvements of this method have focused on increasing of its reliability. Here we report the development of a genotyping method where a microarray was spotted with stem-loop probes, especially designed to optimize the hybridization specificity of complementary DNA sequences. This accurate method was used to screen for several common disease-causing mutations involved in a neurological disorder called Charcot-Marie-Tooth disease (CMT). Healthy individuals and patients DNA were amplified and labeled by PCR and hybridized on microarray. Signal intensities of wild type probes were considerably higher than their homologues mutant probes differing by only one nucleotide (discrimination ratio) for healthy individual "homozygous" DNA. On the other hand, "heterozygous" mutant DNA samples gave rise to signal intensity ratios close to 1 at mutation positions, as expected with approximately equivalent signals of wild type and mutant probes. These results were obtained either with individually amplified PCR products, or with multiplex PCR products combining several amplicons. Our system combines then the highly specific genotyping principle of stem-loop structure probes with the advantages of a microarray method that allows highly multiplexed and parallel analysis.
